苹果黑腐皮壳菌Valsa mali的两类效应蛋白VmHEPs及VmPODs的功能及机制研究

摘要

苹果黑腐皮壳菌Valsa mali是导致苹果树腐烂病的主要植物病原真菌，极大威胁我国的苹果产业。植物病原真菌在侵染寄主的过程中需要多种重要的致病因子参与，效应蛋白则是其中非常关键的一类。目前所发现的植物病原真菌的效应蛋白大多都不具有保守功能域，但这些具有保守功能域的效应蛋白已在植物病原卵菌和细菌中被证实具有极其重要的意义，因此对植物病原真菌中具有保守功能域的效应蛋白的研究有利于深入揭示植物病原真菌的致病机制。Hce2功能域是目前被发现的分布最为广泛的一类植物病原真菌效应蛋白保守功能域，但其致病的作用方式及机制尚不明确；Pod（Peroxidase）功能域在生物生理代谢方面的功能已经被深入研究，但研究多集中于一些含有该功能域的非分泌胞内酶上，该功能域是否能以效应蛋白的形式参与植物病原真菌致病的过程尚不清楚。 目前，V.mali中尚未发现具有保守功能域的效应蛋白。本研究基于一系列生物信息学技术和分子生物学技术对V.mali中含有Hce2功能域的五个效应蛋白VmHEPs（VmHEP1、VmHEP2、VmHEP3、VmHEP4和VmHEP5）进行了挖掘和功能研究，并对其中具有激发植物细胞坏死功能的VmHEP1进行了上游调控及下游靶标的进一步筛选和研究；与此同时，本研究还发现了一类含有Pod（Peroxiadase）功能域的效应蛋白普遍存在于各种不同植物病原真菌中，并通过功能研究证明V.mali中的三个该类型效应蛋白VmPODs（VmPOD1、VmPOD2和VmPOD3）对V.mali的生存和致病有都重要贡献。主要研究结果如下： (1)含Hce2功能域的效应蛋白VmHEPs以串联基因冗余互补的方式参与V.mali致病过程 本研究首先从88个候选效应蛋白中鉴定得到一个具有Hce2保守功能域且能引起植物细胞坏死的效应蛋白VmHEP1，进一步从分泌蛋白组中鉴定出四个与VmHEP1同源且具有分泌功能的同源蛋白（VmHEP2、VmHEP3、VmHEP4和VmHEP5）；经过基因瞬时表达确认，在VmHEPs中仅有VmHEP1能够引起细胞坏死；进化分析显示五个VmHEPs基因是旁系同源基因（paralogs），其中的VmHEP1和VmHEP2属于symparalogs（in-paralogs），而其他三个基因属于alloparalogs（out-paralogs），此外，在进化过程中五个基因两两之间并未发生显著的非同义氨基酸替换，处于纯化选择状态。致病力检测发现，分别敲除VmHEPs单个基因后，V.mali的致病力并未发生改变，但VmHEPs中VmHEP1和VmHEP2基因在侵染早期均明显的上调，将VmHEP1和VmHEP2同时敲除后，V.mali致病力发生显著下降。后续分析发现，VmHEP1和VmHEP2均处于11号染色体且两者间物理位置仅仅相距604bp，与此同时qRT-PCR显示在V.mali侵染苹果枝条时，VmHEP1的缺失会显著促进VmHEP2上调，反之VmHEP2的缺失也会促进VmHEP1的显著上调。本研究证明V.mali的五个VmHEPs基因是不同种类的旁系同源基因，处于纯化选择状态，其中的VmHEP1能够激发细胞坏死，同时VmHEP1与VmHEP2是V.mali的重要毒性因子，以基因冗余互补的方式参与致病，同时说明植物病原真菌的效应蛋白可以通过基因串联拷贝的冗余协作模式参与致病。 (2)VmHEP1基因的上游非编码区具有受侵染事件诱导的基因启动功能并且效应蛋白VmHEP1能够与苹果蛋白MdLRRP1互作 本研究进一步对VmHEPs中唯一可以引起细胞坏死的效应蛋白VmHEP1进行了上游启动区域功能和下游互作靶标的鉴定和研究。基因组信息分析发现VmHEP1基因的上游1500bp为非编码区域；基于V.mali的遗传转化体系，本研究证实该1500bp非编码区域内存在启动区域能够在V.mali中启动转入的外源GFP基因，并且通过qRT-PCR证实该启动区域的启动功能受到侵染事件的诱导。此外，通过酵母双杂筛选、免疫共沉淀技术和质谱技术验证，发现效应蛋白VmHEP1能够与一个来自苹果的具有富亮氨酸重复结构域（LRR）的蛋白激酶MdLRRP1结合；进一步利用VIGS技术将MdLRRP1基因在本氏烟中的同源基因NbSERK3进行基因沉默，并在基因沉默植株中进行VmHEP1的瞬时表达，最终通过电解质渗透率检测发现效应蛋白VmHEP1所引起的本氏烟叶片细胞坏死程度在NbSERK3基因被沉默的基因沉默植株中显著降低。本研究证实了VmHEP1基因上游存在一个受侵染事件诱导的启动区域，并且初步鉴定了效应蛋白VmHEP1能够与苹果中的靶标蛋白MdLRRP1结合和互作。 (3)含Pod功能域的效应蛋白VmPODs对V.mali的产孢、H2O2耐受能力和致病力有显著影响且普遍存在于其它真菌中 为了探究苹果黑腐皮壳菌中是否存在尚未被关注的具有保守功能域的效应蛋白，本研究根据效应蛋白特征对基因组和分泌蛋白组进行了进一步分析，分析发现了三个具有信号肽且拥有Pod（Peroxidase）保守功能域的候选效应蛋白VmPOD1、VmPOD2以及VmPOD3。序列分析显示，VmPOD1具有两个过氧化氢酶功能域；VmPOD2具有一个氯化物过氧化物酶功能域；VmPOD3具有一个植物类过氧化物酶功能域。酵母系统的分泌试验证明三个候选效应蛋白均具有分泌功能。分别对3个基因进行敲除后发现△VmPOD1、△VmPOD2以及△VmPOD3的营养生长未受影响，但其分生孢子的产生能力相比于野生型03-8显著下降；与此同时，△VmPOD1、△VmPOD2和△VmPOD3在添加有0.06mol/L H2O2的PDA上受到比野生型03-8更为严重的抑制，说明三个候选效应蛋白参与应对外部环境中H2O2的胁迫压力；进一步qRT-PCR显示三个VmPODs基因均在V.mali侵染苹果的初期显著上调，可能参与了V.mali侵染早期与苹果的互作；并且VmPODs在本氏烟叶片中瞬时表达后能够显著抑制坏死激发子INF1引起的烟草叶片电解质渗漏，显示VmPODs一定程度上抑制了INF1激发的细胞坏死，干扰了INF1激发的植物抗病反应。除此之外，基因敲除突变体△VmPOD3的致病力显著下降，证实了VmPODs的确直接参与了V.mali的致病过程并对其致病力有显著贡献。进一步序列分析显示，VmPODs同源蛋白广泛存在于不同真菌中，其中VmPOD1存在于27个真菌属中，VmPOD2存在于30个真菌属种，VmPOD3存在于48个真菌属中，其中包括多种重要植物病原真菌。本研究证明VmPODs是一类对V.mali生存和侵染过程有显著贡献的效应蛋白，Pod功能域可以以效应蛋白的方式参与致病，含Pod功能域的候选效应蛋白普遍存在于真菌界中，是一类具有潜在的重要功能的效应蛋白。

目录

声明

第一章 文献综述

1.1 苹果黑腐皮壳菌及其引致的腐烂病研究进展

1.1.1 苹果黑腐皮壳菌（Valsa mali）的病原学和生物学特征

1.1.2 苹果黑腐皮壳菌（V. mali）的侵染规律

1.1.3 苹果黑腐皮壳菌（V. mali）的致病机制

1.1.4苹果黑腐皮壳菌（V. mali）引致的腐烂病的危害及防控

1.2 寄主植物与其病原微生物互作

1.2.1基因对基因假说（Gene for gene hypothesis）

1.2.2植物与病原互作的zigzag模型（Zigzag model）

1.2.3植物与病原互作的入侵模型（Invasion model）

1.3.1 植物病原效应蛋白的概念范畴

1.3.2 不同植物病原的效应蛋白研究

1.3.3 植物病原效应蛋白的转运机制

1.3.4 植物病原效应蛋白的作用机制

1.3.5 Hce2功能域的研究进展

1.3.6 Pod功能域的研究进展

1.4 本研究目的及意义

第二章 含Hce2功能域的效应蛋白VmHEPs通过串联拷贝的冗余互补方式参与致病

2.1 前言

2.2.1 试验菌株与植株

2.2.2 试验载体、试剂及试验仪器

2.2.3 供试培养基

2.2.4 试验所用引物

2.3 试验方法

2.3.1 菌株活化及培养

2.3.2 互作样RNA提取及反转录cDNA获取

2.3.3 农杆菌介导的本氏烟基因瞬时表达

2.3.4 Western印迹杂交检测

2.3.5 信号肽外泌功能验证

2.3.6 苹果黑腐皮壳菌原生质体制备

2.3.7 PEG介导的同源重组基因敲除盒子构建与原生质体转化

2.3.8 转化突变体检测

2.3.9 突变体Southern印迹杂交检测

2.3.10 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

2.3.11 苹果黑腐皮壳菌突变体致病力检测

2.3.12 苹果黑腐皮壳菌突变体生长检测

2.3.13 逆转录PCR（RT-PCR）

2.3.14 序列分析方法

2.4 结果与分析

2.4.1 效应蛋白VmHEPs的挖掘和鉴定

2.4.2 VmHEPs基因及其Hce2功能域的系统发育分析及选择压力分析

2.4.3 五个VmHEPs基因中仅VmHEP1能引起坏死

2.4.4 VmHEPs的信号肽具有分泌功能

2.4.5 VmHEP1与VmHEP2在侵染时显著上调

2.4.6 五个VmHEPs的单基因敲除突变体的PCR检测及Southern杂交确认

2.4.7 VmHEPs单基因敲除未影响致病力

2.4.8 突变体qRT-PCR显示侵染时VmHEP1与VmHEP2 基因功能冗余互补

2.4.9 VmHEP1与VmHEP2的双基因敲除突变体的PCR检测及Southern杂交确认

2.4.10 VmHEP1与VmHEP2双基因敲除突变体致病力显著下降

2.4.11 VmHEP1与 VmHEP2不是V. mali生长必需因子

2.5 讨论

第三章 效应蛋白VmHEP1上游非编码区的启动功能验证及互作靶标筛选鉴定

3.1 前言

3.2.1 试验菌株与植株

3.2.2 试验载体、试验试剂及仪器

3.2.3 供试培养基

3.2.4 试验所用引物

3.3 试验方法

3.3.1 菌株活化及培养

3.3.2 互作样RNA提取及反转录cDNA获取

3.3.3 农杆菌介导的本氏烟体系基因瞬时表达

3.3.4 苹果黑腐皮壳菌原生体制备

3.3.5 PEG介导的同源重组基因敲除盒子构建与原生质体转化

3.3.6 待筛启动子在V.mali中的启动功能验证

3.3.7 逆转录PCR（RT-PCR）

3.3.8 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

3.3.9酵母双杂交试验（Yeast two hybrid，Y2H）

3.3.10 免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation，Co-IP）

3.3.11 银染蛋白胶及质谱测序

3.3.12质谱结果（Raw data）比库分析

3.3.13病毒诱导的基因沉默（Virus induced gene silencing，VIGS）

3.3.14 电解质渗出率检测

3.4 结果与分析

3.4.1 含不同启动子的外源GFP转基因转化菌株获取及PCR检测验证

3.4.2 VmHEP1基因上游1500 bp片段具有启动基因的功能

3.4.3 VmHEP1基因上游1500bp启动功能受侵染诱导

3.4.4 酵母双杂交（Y2H）筛选VmHEP1互作靶标

3.4.5 VmHEP1与候选靶标全长序列在酵母体系中的互作验证

3.4.6 免疫共沉淀（Co-IP）与聚丙烯酰胺凝胶快速银染技术获取待测特异互作样

3.4.7质谱分析验证效应蛋白VmHEP1与MdLRRP1结合

3.4.8 TRV介导的VIGS沉默MdLRRP1在本氏烟中的同源基因NbSERK3

3.4.9 在NbSERK3被沉默的本氏烟中VmHEP1引起的坏死程度显著降低

3.5 讨论

第四章 含Pod保守功能域的效应蛋白VmPODs的鉴定和功能研究

4.1 前言

4.2.1 试验菌株与植株

4.2.2 试验载体、试剂及试验仪器

4.2.3 供试培养基

4.2.4 试验所用引物

4.3 试验方法

4.3.1 菌株活化及培养

4.3.2 互作样RNA提取及反转录cDNA获取

4.3.3 信号肽外泌功能验证

4.3.4 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）

4.3.5 电解质渗出率检测

4.3.6 苹果黑腐皮壳菌原生质体制备

4.3.7 PEG介导的同源重组基因敲除盒子构建与原生质体转化

4.3.8 转化突变体检测

4.3.9 突变体Southern印迹杂交检测

4.3.10 苹果黑腐皮壳菌突变体基因回补

4.3.11 苹果黑腐皮壳菌突变体生长检测

4.3.12 苹果黑腐皮壳菌突变体致病力检测

4.3.13 序列分析方法

4.4 结果与分析

4.4.1 VmPODs挖掘及氨基酸序列分析

4.4.2 三个VmPODs的信号肽具有分泌功能

4.4.3 三个VmPODs基因在侵染时显著上调

4.4.4 VmPODs显著降低INF-1在本氏烟叶片中引起的细胞坏死程度

4.4.5 三个VmPODs基因敲除突变体和回补突变体的PCR检测及Southern杂交确认

4.4.6 VmPODs基因敲除突变体的产孢能力显著降低

4.4.7 VmPODs基因敲除突变体对环境中H2O2的抗胁迫能力显著降低

4.4.8 VmPODs基因敲除突变体中的△VmPOD3致病性显著降低

4.4.9 VmPODs同源蛋白广泛存在于其它植物病原真菌

4.5 讨论

第五章 全文结论与展望

5.1 全文结论

5.2 展望

参考文献

附录

附录A 本研究中所使用试剂配方

附录B 本研究中所使用培养基配方

附录C 第二章研究中使用的引物以及VmHEPs序列分析信息

附录D 第三章研究中使用的引物

附录E 第四章研究中使用的引物

致谢

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