谷子SiWLIM2b基因提高水稻抗旱及耐低氮胁迫的功能研究

摘要

谷子（Setaria italicaL.）起源于我国，具有抗旱、耐贫瘠的特点。谷子基因组小，随着谷子基因组的发布，谷子已经成为研究单子叶作物抗逆性的理想材料。然而，目前谷子功能基因研究刚刚起步，谷子特有的抗逆调控机制仍然了解很少。开展谷子抗逆功能基因组研究将为单子叶作物抗逆分子育种研究提供新的思路。本实验室前期通过对低氮和干旱处理的谷子幼苗进行了转录组测序，鉴定出了一个在低氮胁迫处理下上调、干旱胁迫下调的谷子基因SiWLIM2b，SiWLIM2b来自于LIM（Mec-3，Lin-11，Isl-1）基因家族。通过生物信息学的方法对谷子基因组中LIM基因家族进行分析，共鉴定10个谷子LIM家族基因，并对该家族基因的特性及表达谱进行分析。为了进一步研究谷子SiWLIM2b基因的功能，将SiWLIM2b基因转化水稻，鉴定转SiWLIM2b基因水稻的抗逆性。取得的试验结果如下： 1.对谷子基因组进行比对共鉴定到10个LIM家族基因，进化树分析表明LIM基因家族的分化是在单子叶和双子叶植物分化之后形成的。基因染色体分布结果表明，谷子LIM基因家族的形成发生在谷子染色体复制事件之后。表达谱分析表明，谷子LIM家族基因受到多种非生物胁迫及外源激素诱导表达。 2.谷子SiWLIM2b基因全长600bp，编码199个氨基酸，相对分子量22.02kD，预测的等电点为8.98。亚细胞定位分析表明，谷子SiWLIM2b蛋白聚集在细胞质及细胞核中。组织特异性表达分析表明，SiWLIM2b基因在根中表达量最高。 3.在干旱处理下，转SiWLIM2b基因水稻生长情况明显优于受体水稻，其叶片MDA含量明显低于受体水稻，叶绿素含量及脯氨酸含量显著高于受体水稻，并且木质素含量较受体水稻降低，类黄酮含量高于受体水稻。 过表达SiWLIM2b基因影响了转基因水稻中苯丙烷途径相关基因的表达，双萤光素酶报告实验结果表明，谷子SiWLIM2b基因可以直接结合苯丙烷途径相关下游基因包括CAD、PAL、CCR2、4CL2的启动子区域。这些实验结果表明，SiWLIM2b基因通过影响苯丙烷次级代谢途径，从而增强转基因水稻抗旱性。 4.低氮处理下，转SiWLIM2b基因水稻生长情况明显优于受体水稻。转基因水稻体内氨同化途径的关键酶谷氨酰胺还原酶含量较受体水稻有明显上调。这些试验结果表明，SiWLIM2b基因通过增强氨同化作用从而在低氮胁迫过程中发挥作用。 这些研究结果为进一步解析谷子基因SiWLIM2b的抗逆机理奠定了基础，同时为作物的抗逆遗传改良提供了新的候选基因。

目录

声明

主要符号对照表

第一章 文献综述

1.1 植物抗旱研究进展

1.1.1 干旱对植物生长发育的影响

1.1.2 植物抗旱性评价指标

1.2 植物耐低氮胁迫研究进展

1.3.1 LIM结构域的发现

1.3.2 LIM类蛋白的功能

1.4植物苯丙烷次级代谢途径

1.4.1木质素

1.4.2类黄酮

1.5.1实时荧光定量PCR

1.5.2亚细胞定位技术

1.5.3双萤光素酶报告实验

1.5.4 ELISA技术

1.6研究目的和意义

1.7技术路线

第二章 谷子LIM 基因家族的鉴定及特性分析

2.1引言

2.2材料和方法

2.2.1谷子LIM基因鉴定

2.2.2谷子LIM基因的系统进化分析

2.2.3谷子LIM基因染色体定位分析

2.2.4谷子LIM基因外显子-内含子基因结构分析及功能结构域分析

2.2.5谷子LIM基因的启动子区域顺势作用元件分析

2.2.6谷子LIM基因对外源激素及非生物逆境胁迫的响应

2.3 结果与分析

2.3.1谷子LIM基因系统进化关系及染色体定位分析

2.3.2谷子LIM基因功能结构域及基因结构分析

2.3.3谷子LIM基因的启动子分析

2.3.4谷子LIM家族基因在不同外源激素及非生物胁迫处理下表达量分析

2.4讨论

第三章 谷子SiWLIM2b的特性及其在干旱及低氮胁迫下的功能分析

3.1 引言

3.2.1植物材料

3.2.2谷子幼苗外源激素及非生物胁迫逆境处理

3.2.3SiWLIM2b基因的扩增

3.2.4 SiWLIM2b基因在不同胁迫下表达谱分析

3.2.5 SiWLIM2b亚细胞定位分析

3.2.6 SiWLIM2b蛋白的转录活性分析

3.2.7转SiWLIM2b基因水稻对干旱和低氮胁迫的响应

3.2.8株高、根长及可溶性蛋白含量测定

3.2.9谷氨酰胺合成酶含量测定

3.2.10氮吸收利用相关基因的表达

3.2.11苯丙烷次级代谢途径相关基因在转基因水稻及受体水稻籽苗中差异表达分析

3.2.12双荧光素酶报告实验

3.2.13 转基因水稻及受体水稻木质素含量测定

3.2.14转基因水稻及受体水稻类黄酮物质含量测定

3.3结果与分析

3.3.1谷子基因SiWLIM2b的扩增

3.3.2谷子基因SiWLIM2b的组织特异性表达及在不同处理下的表达谱

3.3.3谷子蛋白SiWLIM2b亚细胞定位

3.3.4 SiWLIM2b蛋白的转录激活活性

3.3.5转SiWLIM2b基因水稻盆栽试验分析

3.3.6转SiWLIM2b基因水稻PEG模拟干旱处理表型分析

3.3.7苯丙烷途径相关基因表达分析

3.3.8双荧光素酶实验验证SiWLIM2b基因对苯丙烷途径相关基因启动子调控活性分析

3.3.9 SiWLIM2b对过表达水稻木质素及类黄酮含量的影响

3.3.10低氮水培处理后，转基因水稻幼苗表型分析

3.3.11氮吸收利用相关基因的表达

3.4讨论

第四章 结论和创新点

4.1结论

4.1.1谷子LIM家族基因分析

4.1.2谷子SiWLIM2b基因分子生物学特性分析

4.1.3过表达谷子SiWLIM2b基因可以提高转基因水稻对干旱和低氮的耐受性

4.2创新点

参考文献

附录A

致谢

个人简历