人类细胞色素P450 3A4多态性等位基因及其嵌合体3A43/3A4的酶动力学研究

摘要

人类细胞色素P450(Cytochrome P450，CYP)是代谢许多重要的内源性和外源性化合物及其前致癌物的一类氧化酶。其中CYP3A4是最重要的P450酶之一，参与45～60％常用药物在体内的代谢转化过程。CYP3A4酶活性具有明显的个体差异，不仅表现为肝脏表达水平差异高达40倍，且其底物的体内代谢也可相差10倍左右。在CYP3A4活性的个体差异中，基因作用占60～90％，其中最主要的原因是CYP3A4基因多态性。目前，许多CYP3A4等位基因被发现并进一步证实是造成个体之间药物代谢差异的一个重要因素。 采用重叠延伸PCR法构建CYP3A4原生株和19个突变株及其嵌合体CYP3A43/3A4的重组质粒，选用酿酒酵母表达系统，大量诱导并制备酵母微粒体。半乳糖诱导CYP3A43/3A4、CYP3A4及其突变株高效表达，微粒体蛋白浓度平均为15～20mg/mL。荧光探针底物DBF(Dibenzylfluorescein)和BOMCC进行酶活性检测及酶动力学参数测定，以CYP3A4特异性抑制剂酮康唑进行抑制性试验。底物浓度和酶浓度经多个稀释梯度求出最适值：选取底物DBF浓度为1.0μmol/L，BOMCC浓度为10.0μmol/L，酵母微粒体浓度为0.25 mg/mL为本实验的基本条件。 对CYP3A4原生株及其突变株和嵌合体CYP3A43/3A4的研究表明：用酿酒酵母表达人的药物代谢酶是研究与药物代谢相关问题的一个很好途径。酵母自身的细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450 Reductase，CPR)被证实在酵母细胞的电子传递中是有效的，与哺乳动物细胞CPR相近，且酵母细胞中本底CYPs含量相对较低，生长周期较短，培养条件相对简单，表达量和催化活性相对较高；其次，CYP3A4原生株的酶动力学参数Vmax和Km与已公布的相同；另外，从Vmax/Km来看，与CYP3A4原生株相比，G56D、R162Q、V170I代谢DBF和BOMCC的能力没有显著改变，而T185S、P218V、S222P、L293P的活力均下降，其中L293P活力为最低，达到了原生株的1/3。CYP3A43/3A4与原生株的酶动力学参数相近，酮康哗对其也显示出强的抑制作用。 多种荧光探针底物和多种上市药物对人细胞色素P450 3A4原生株及19株非同义突变株的酶动力学研究实验正在进行中，旨在建立一种新的针对于CYP3A4遗传多态性的药物筛选平台，从而为临床个体化用药提供科学依据。

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文摘

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声明

缩略语表

文献综述

1 P450研究进展

1.1 P450分布与命名

1.2 P450结构特征

1.3 P450主要功能

1.4 P450酶系的催化机制

2人细胞色素P450 3A4及其单核苷酸多态性的研究进展

2.1 3A4在P450中的重要地位

2.2 3A4 SNPs存在及意义

2.3 3A4 SNPs应用前景

3反式剪接形成的CYP3A43/3A4的研究

3.1概念

3.2反式剪接机制

3.3 CYP3A43/3A4的研究

4立题背景及意义

实验内容

一CYP3A4原生株及其突变株的基因克隆，蛋白表达及酶活性检测

1材料

2方法

3结果与分析

4讨论

二 反式剪接形成的人类细胞色素P450嵌合体3A43/3A4的研究

全文总结

参考文献

致谢

附表