苦荞离体再生体系的建立和遗传转化研究

摘要

本文试图通过基因工程技术来提高苦荞的耐盐性，期望获得优良抗逆新品系，这对我国苦荞种植业的发展有重要的意义。 以苦荞的子叶和下胚轴为外植体研究了苦荞植株再生的胚状体发生途径和器官发生途径，建立起苦荞的高频再生体系。试验结果表明来自下胚轴的胚性愈伤组织在附加2.0 mg·L<'-1> BA、0.5 mg·L<'-1> KT、0.1 mg·L<'-1> NAA的1/2MS培养基上芽的诱导率最高达到76％，来源于子叶的胚性愈伤组织在附加1.0 mg·L<'-1>BA、0.1 mg·L<'-1> KT、0.1 mg·L<'-1> NAA的1/2MS培养基上下芽的诱导率也达到71％。MS+1 mg·L<'-1>NAA是适宜的再生苗生根培养基。 在建立苦荞胚状体发生途径再生体系的基础上，采用携带拟南芥AtNHX1基因的根癌农杆菌LBA4404菌株转化苦荞子叶和下胚轴，最终获得了具有卡那霉素抗性的愈伤组织，并分化形成了转基因植株。经PCR、RT-PCR和Southern检测证实AtNHX1基因已成功地整合到苦荞基因组中。对转基因愈伤组织及其再生植株进行NaCl胁迫试验，发现在不同的盐浓度下转基因愈伤组织和再生植株的生长状态均明显优于未转化的对照组，转化的愈伤组织在NaCl浓度为1.5％时愈伤组织仍能存活。转化植株在1％NaCl胁迫时植株生长状况明显优于未转化植株，表明AtNHX1基因导入后确实可以提高苦荞组织的耐盐性。 高效液相层析实验结果显示在愈伤组织形成过程中芦丁含量会明显下降，子叶愈伤组织中的芦丁含量从16.8 mg/g降到了6.3 mg/g，下胚轴愈伤组织中的芦丁含量从7.4 mg/g降到了3.9 mg/g，降幅分别达到62.5％和47.3％，说明芦丁含量在脱分化的细胞含量会降低。大田植株与通过胚状体发生途径获得的苦荞再生植株中的芦丁含量无显著差异。而在1％NaCl胁迫时，导入AtNHX1基因的转化植株与未转化植株相比叶片中芦丁含量提高明显，最高增幅达9.2％，在种子中增幅最高达2.5％。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一部分苦荞离体再生体系的建立和的遗传转化研究

Ⅰ文献综述

1农杆菌遗传转化的研究进展

2植物耐盐基因工程研究进展

3本研究的内容、目的和意义

第一章苦荞离体培养体系的建立

Ⅰ材料与方法

1植物材料

2培养基

3试验仪器

4试验设计与分析方法

Ⅱ试验步骤

1通过胚壮体发生途径诱导再生苗

2通过器官发生途径诱导再生苗

Ⅲ结果与分析

1不同激素组合的对不同的外植体愈伤组织诱导的影响

2影响胚性愈伤组织形成的因素

3胚性愈伤组织形态分化的影响因素

4不同激素浓度对根诱导的影响

5器官发生途径形成再生苗

6愈伤组织褐变的抑制

Ⅳ讨论

第二章根癌农杆菌介导的遗传转化

Ⅰ试验材料

1无菌外植体培养

2农杆菌菌株的制备

3主要试剂的配制

Ⅱ试验方法

1根癌农杆菌侵染、共培养

2选择培养及转化植株再生

3转基因苦荞再生植株的分子生物学鉴定

4转基因苦荞对NaCl胁迫的抗性分析

Ⅲ结果与分析

1根癌农杆菌对不同外植体转染频率的影响

2不同转染时间对愈伤组织生长的影响

3筛选体系的优化

4苦荞基因组DNA提取

5转基因愈伤组织的PCR检测

6转基因再生植株的RT-PCR检测

7转基因再生植株的Southern印记检测

8转化愈伤组织和转基因再生植株对NaCl的抗性研究

Ⅳ讨论

第2部分苦荞再生苗和遗传转化苗芦丁含量的研究

Ⅰ文献综述

1苦荞中芦丁的研究进展

2芦丁含量的分析方法

Ⅱ材料与方法

1试验仪器

2药品试剂

3标准曲线测定

4样品的测定

5苦荞愈伤组织中芦丁含量的测定

6苦荞再生苗与大田植株各组织芦丁含量

7苦荞转化植株和大田植株在盐胁迫下芦丁含量分析

Ⅲ结果与讨论

1标准曲线的绘制

2不同培养天数的愈伤组织中芦丁含量的变化

3苦荞再生苗与大田植株各组织芦丁含量的分析

4盐胁迫下苦荞转化苗与大田植株各组织的芦丁含量分析

Ⅲ结果与分析

结论

参考文献

致谢