人CYP2D6多态性酶的体外表达及其在药物筛选中的应用

摘要

CYP2D6是P450家族中一种极为重要的药物代谢酶，参与多种药物的代谢；同时，又是一种极具多态性的酶，含有70多种等位基因，上百个SNP位点，代谢药物时表现出明显的个体差异；而且通过与之作用，药物与药物之间常常发生相互作用而引起药物不良反应。为了研究CYP2D6 SNP酶的活性差异和药物对不同SNP酶的作用差异，我们通过单位点突变技术得到了G169R，P34S，E410K，V7M，Q151E 5个SNP株，并使其在酿酒酵母中表达，制备蛋白微粒体，再分别用2D6的探针底物丁夫洛尔和特异性抑制剂奎尼丁对各酶进行了鉴定。最后，在2D6的荧光底物AMMC下，对药物进行抑制性筛选，求出各药的IC50值，分析不同的药对不同的SNP酶的抑制作用差异。结果如下： 1.CYP2D6 WT和5个SNP克隆与表达 DNA测序结果表明，通过PCR定点突变技术得到的5个SNP株G169R，P34S，E410K，V7M，Q151E成功引入了突变碱基；通过Western Blot证实，重组的WT和5个SNP酶在酿酒酵母中成功得到了表达；用CO-还原示差光谱法对各酶的含量测定时发现，只有CYP2D6-WT、V7M在450mm处有吸收峰，含量分别为：16.5pmol/mg、101.6pmol/mg。 2.CYP2D6 WT和5个SNP重组酶活性的测定用底物丁夫洛尔和AMMC测得的CYP2D6 Wt的Km、Vmax、Vmax/Km值分别为19.8μM、175.4 pmol/min/mg、8.9μl/min/mg；2.39μmol/L、22.8pmol/min/mg、9.8μL/min/mg。与WT相比较，V7M活性均要高，G169R、E410K和Q151E均稍低，P34S活性都要低很多。 3.特异性抑制奎尼丁能强烈的抑制CYP2D6 WT和5个SNP的活性，半数抑制常数IC50值均不大于0.1μmol/L。 4.药物对CYP2D6 WT的抑制在探针底物丁夫洛尔和荧光底物AMMC下，23种药对CYP2D6 WT进行抑制实验求得各药的IC50值，比较发现，在两种底物下，大部分药物的IC50值都相差不大。把IC50值分别进行取对数后作图，得到二者的相关系数R2=0.75。 5.不同药物对不同SNP酶的抑制药物对WT、SNPl和SNP2的抑制程度排序均为：氯丙嗪>氟西汀>阿米替林>舍曲林>酮康唑(=曲格列酮)；同一种药对不同酶的半数抑制常数表现出不同程度的差异。 总之，本实验采用酿酒酵母表达系统成功表达了具有催化活性的CYP2D6WT及5个SNP酶；基于荧光底物AMMC建立的体外重组酶药物抑制筛选平台是可行的：细胞色素P4502D6(CYP2D6)单核苷酸替换后，与野生型相比，酶动力学特征有明显差异，酶对药物抑制的敏感性发生了一定变化。

目录

文摘

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论文说明：英文缩略语表

声明

第一章文献综述

1细胞色素P450酶的研究进展

1.1 CYP450酶的命名与分布

1.2 CYP450酶的结构与性质

1.3 CYP450酶与药物代谢

1.4 CYP450研究技术的进展

2 CYP2D6的概述

2.1、CYP2D6的基因序列与结构

2.2 CYP2D6的基因多态性

2.3 CYP2D6与药物代谢

第二章CYP2D6基因的克隆与表达

1材料与仪器

1.1 CYP2D6 WT的基因序列

1.2菌株和质粒

1.3试剂

1.4主要溶液

1.5主要仪器

2方法

2.1 PCR引物的设计

2.2 CYP2D6-WT和各SNP表达载体的构建与鉴定

2.3酵母重组表达菌株的获得

2.4目的蛋白的表达和鉴定

3结果与分析

3.1 CYP2D6-WT和各SNP表达载体的构建与鉴定

3.2目的蛋白的表达和鉴定

4讨论

4.1表达系统的选择

4.2表达产物的分析

第三章CYP2D6酶活性的检测

1、材料与仪器

1.1 2D6酶蛋白微粒体

1.2主要试剂

1.3主要溶液

1.4主要仪器

2实验方法

2.1重组酶对探针底物丁夫洛尔1'-羟基化活性的检测

2.2重组酶对荧光底物AMMC去甲基化活性的检测

3结果与分析

3.1 CYP2D6酶与阴性对照的比较（电转空载体，不含2D6）的比较

3.2 P450氧化还原酶(POR)对2D6活性的影响

3.3重组酶对探针底物丁夫洛尔1'-羟基化活性的检测

3.4重组酶对荧光底物AMMC去甲基化活性的检测

4讨论

4.1酵母内源P450酶系统对重组2D6酶活性的影响

4.2 CYP2D6 WT活性分析

4.3 2D6多态性对酶活性的影响

第四章药物筛选

1材料与方法

1.1实验材料

1.2试剂

1.3主要仪器

1.4实验方法

2结果与分析

2.1基于两种底物的药物筛选结果的对照

2.2特异性抑制奎尼丁对CYP2D6-WT和各SNP酶的抑制

2.3不同酶对不同药交叉筛选的IC50值

3讨论

3.1基于探针底物和荧光底物药筛的比较

3.2药物与药物的相互作用与CYP2D6的关系

3.3 2D6的多态性对药物与药物相互作用的影响

全文小结

参考文献

附录

研究生期间已发表论文

致谢