皮肤组织干燥保存的研究

摘要

摇蚊幼虫能在脱水状态下存活，即体内水分完全丧失，新陈代谢活动几乎全部停止，但摇蚊幼虫仍保持存活，并在适宜条件下恢复生命活动，这就是所谓的隐生现象。此外，在缓步类动物门水熊中也观察到隐生现象。进一步研究发现这些生物体在干燥状态下可以合成、积累大量海藻糖，耐受干燥。对上述现象的研究有可能实现动物组织和器官的干燥保存，避免了目前深低温保存的种种缺陷，例如冰晶损伤和运输不便等。 本研究首先探索了海藻糖导入皮肤组织的最佳条件，为皮肤组织干燥保存提供了依据。然后，对负载海藻糖的皮肤组织进行干燥处理，并在室温下保存一定时间后进行活性检测(包括荧光染色和MTT分析)。最后，通过自体移植评价干燥保存皮肤修复皮肤缺损的效果。 1．优化海藻糖导入皮肤组织的条件。海藻糖是一种非渗透性的非还原型双糖，正常情况下不能主动进入细胞。以不同海藻糖浓度、孵育温度和孵育时间为变量，探索海藻糖载入皮肤的最佳浓度，温度和时间。用80％甲醇提取后用葸酮法测定海藻糖进入皮肤组织的浓度。结果显示，皮肤组织海藻糖最佳导入条件为：加载液海藻糖浓度800mM、孵育温度37℃、孵育时间7h。 2．皮肤组织干燥保存研究。负载海藻糖的皮肤组织分两组进行干燥，一组冻干，另一组吹干。加载海藻糖皮肤干燥后用荧光标记直接显示皮肤的活性状况，MTT分析定量测定皮肤活性，此外，还进行了HE染色和透射电镜观察，对比干燥皮肤和新鲜皮肤的组织结构以及细胞内外结构差异。结果表明：荧光染色的干燥皮肤，在70-80％区域可见绿色荧光（活性区域），MTT分析表明干燥皮肤仍保持有50％左右的活性。HE染色和透射电镜结果也表明两者在内部结构上无显著差异。 3．自体移植试验。通过最有效的评价手段—自体移植，观察干燥再复水皮肤在自体动物身上存活情况。自体移植结果显示冻干皮肤能存活长达15d，晾干皮肤最长存活13d。

目录

文摘

英文文摘

声明

第一章 文献综述

1.1组织器官干燥保存技术

1.1.1组织器官干燥保存概念及发展

1.1.2干燥保存的研究内容

1.1.3干燥保存中存在的问题

1.2海藻糖的作用机制

1.2.1海藻糖简介

1.2.2海藻糖保护机理的假说

1.2.3海藻糖在组织器官保存中的应用前景

1.3本实验研究的目的、意义及实验内容

1.3.1目的与意义

1.3.2实验内容

第二章 试验材料与方法

2.1主要试剂与仪器

2.1.1试剂

2.1.2试验仪器

2.1.3实验器械

2.2试剂的配制

2.2.1胎牛血清的储存和灭活

2.2.2 DMEM培养基的配制

2.2.3 MTT溶液的配制

2.2.4脱毛剂的配制

2.2.5无钙镁磷酸缓冲液[PBS(-)]的配制

2.2.6生理盐水的配制

2.2.7 10％缓冲福尔马林固定液的配制

2.3试验方法

2.3.1葸酮硫酸法

2.3.2苏木精-伊红(HE)染色方法

2.3.3透射电镜分析

2.3.4荧光标记

2.3.5 MTT活性分析

2.3.6移植方法

2.3.7统计学分析

第三章 海藻糖导入组织过程的研究

3.1海藻糖导入细胞和组织的文献综述

3.1.1植物组织海藻糖的导入

3.1.2哺乳动物细胞中海藻糖的导入

3.1.3组织器官中海藻糖的导入

3.2海藻糖浓度对皮肤组织海藻糖导入的影响

3.3孵育温度对海藻糖导入量的影响

3.4孵育时间对海藻糖导入量的影响

3.5海藻糖导入皮肤组织的最佳条件

第四章 负载海藻糖皮肤组织的干燥保存

4.1干燥过程研究

4.1.1冻干研究

4.1.2吹干研究

4.2干燥皮肤不同保存条件及水化

4.2.1干燥皮肤保存条件

4.2.2水化过程

4.3干保存皮肤组织的活性研究

4.3.1结构研究

4.3.2荧光标记

4.3.3 MTT活性分析

4.3.4自体移植

第五章研究总结与展望

5.1结论

5.2本实验不足和展望

参考文献

攻读硕士学位期间取得的学术成果

致谢