一种利用基因表达变化检测鉴别抑菌物质的新方法

摘要

自1929年第一个抗生素—青霉素被偶然发现，抗生素对人类的健康有重要意义。然而由于抗药性的出现和蔓延，临床使用的抗生素在逐渐失去效用，开发新的抗生素已成为人类医学和微生物学的一个紧迫课题。 本文构建了大肠杆菌、沙门氏杆菌、铜绿假单胞菌组成的可高通量分析检测潜在抗生素化合物的筛选模型，并进行了初步应用研究。 首先，本研究采用含无启动子的luxCDABE作为报道子的质粒pCS26为载体，构建了6个含胁迫相关的基因作为启动子的报道子；对实验室保存的沙门氏菌随机启动子库，用低于抑制浓度的羧苄青霉素和环丙沙星进行了筛选，获得了20个对抗生素敏感基因；连同实验室前期筛选的对低于抑制浓度的羧苄青霉素和环丙沙星敏感的3个铜绿假单胞菌基因以及phzAl基因，共30个基因。采用12种抗生素对这些基因进行筛选，明确抗生素对启动子的表达作用，最终建立了一个含有13个启动子的抗生素筛选模型。通过事先未知的抗生素对该筛选模型中启动子的作用与12种抗生素对这些启动子的作用比较，发现这一未知抗生素的表现与庆大霉素、大观霉素、四环素相近，鉴定该抗生素后发现这一未知抗生素就是与庆大霉素、大观霉素同族的硫酸新霉素，证明了该体系具有筛选潜在抗生素的功能。 随后，以该模型为平台，对30种化合物或中药提取物进行了筛选，发现9种化合物或中药提取物具有抑菌作用，同时对启动子具有与已知抗生素类似的作用，具有潜在抗生素的性质；同时，对土壤微生物筛选，发现12株对启动子具有调节作用的菌株，说明这些微生物有可能是抗生素产生菌株。化合物或中药提取物以及土壤微生物的作用及机制有待进一步深入。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：图表目录、缩略用语

声明

第一部分引言

1.1抗生素概述

1.1.1抗生素的历史发展和分类

1.1.2抗生素的耐药

1.1.3低于抑制浓度抗生素作用

1.1.4新抗生素筛选模型

1.2三种常见的革兰氏阴性致病菌

1.2.1铜绿假单胞菌

1.2.2沙门氏菌

1.2.3大肠杆菌

1.3研究内容

第二部分实验材料和方法

2.1试验材料

2.1.1菌株、质粒和生长条件

2.1.2培养基

2.1.3试剂

2.1.4仪器

2.2实验方法

2.2.1质粒的小量提取

2.2.2质粒或DNA片断的酶切和连接

2.2.3感受态细胞的制备

2.2.4电转化

2.2.5启动子——报道子载体的构建

2.2.6测定不同种类抗生素对沙门氏菌的抑制浓度

2.2.7抗生素对沙门氏菌随机启动子文库的筛选方法

2.2.8 DNA测序和序列分析

2.2.9固体平板上抗生素对启动子影响情况

2.2.10液体培养基中抗生素对启动子影响情况

2.2.11化学溶剂及中药提取物对细菌启动子影响情况

2.2.12土壤浸出液对细菌启动子影响情况

2.2.13土壤微生物交叉实验

第三部分实验结果

3.1大肠杆菌重组质粒的构建

3.2对抗生素敏感的沙门氏菌随机启动子文库的筛选

3.2.1确定抗生素对沙门氏菌的抑制浓度

3.2.2低于抑制浓度抗生素对沙门氏菌随机启动子文库的筛选

3.3抗生素对启动子筛选

3.3.1固体平板上最适抗生素浓度的确定

3.3.2固体平板上抗生素对启动子影响情况

3.3.3液体培养基中抗生素对启动子的影响

3.3.4所建立的抗生素筛选模型的可行性验证

3.4中药提取物以及化学样品对细菌基因表达的调节

3.5土壤浸出液对细菌基因表达的调节

3.5.1土壤浸出液中微生物的富培养条件

3.5.2土壤浸出液对细菌启动子的影响

第四部分讨论

参考文献

致谢