单倍体相合造血干细胞移植后T细胞免疫重建规律的初步研究

摘要

研究背景和目的：
　　造血干细胞移植(hematopoietic stem cell transplantation,HSCT)是白血病、淋巴瘤和重型再生障碍性贫血等血液系统疾病的有效治疗方法。然而,由于供受者之间严格的人类组织相容性抗原(human leukocyte antigen,HLA)的限制,不足30％患者可以接受HLA相合HSCT。然而,单倍体相合造血干细胞移植(Haplo-identical HSCT,Haplo-HSCT)则适用于几乎所有患者。
　　自1983年Powles等首次报告Haplo-HSCT以来,血液学家对这种新的移植方式进行了初步的临床研究。但是,早期的临床试验是不成功的,多数患者死于移植排斥和重度移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)。近几年,人们对Haplo-HSCT的方案进行了改良和完善,使Haplo-HSCT两年无病存活率接近HLA相合HSCT,也使我国Haplo-HSCT处于国际领先水平。我们在国内较早开展了Haplo-HSCT,建立了比较成熟的预处理和GVHD预防方案,取得了较好的效果。
　　然而,Haplo-HSCT后免疫重建严重迟缓,持续的细胞免疫功能低下,导致感染和复发,已成为移植后患者主要死亡原因。
　　由于T细胞既是细胞免疫的重要参与者,又是体液免疫的调节者,因此T细胞免疫重建最受关注。其重建主要有两条途径:
　　(1)外周途径:移植物中的T细胞在外周免疫器官内快速扩增,这种方式不依赖胸腺功能;
　　(2)胸腺依赖途径:T淋巴祖细胞迁徙至胸腺,在胸腺内发育成熟,产生具有多样性T细胞受体(T cell receptor,TCR)的初始T淋巴细胞(naive T lymphocyte,naive T,初始T细胞),形成稳定持久的免疫重建。然而,为预防急性GVHD的发生,Haplo-HSCT常采用体外去除移植物中T细胞,或受者静脉输注抗人胸腺细胞免疫球蛋白(anti-thymocyte globuline,ATG)以内源性去除T淋巴细胞,T细胞免疫重建更多依赖第二条途径。
　　近几年,随着分子及细胞免疫学的发展,产生了一些新的免疫状态的监测方法,如通过T细胞受体切除环(T-cell receptor excision circle,TREC)数量和T细胞受体β链可变区(T-cell receptor β chain variable region,TCRVβ)多样性来评估胸腺输出功能,通过CD4+T细胞产生的ATP数量(ImmuKnow技术)评价T细胞总体功能等,这些方法已经实体器官移植中得以应用;同时,也有一些涉及HSCT的报告相继发表。
　　尽管人们已经认识到Haplo-HSCT免疫重建的重要性,但是,有关T细胞免疫重建的规律及其影响因素等,系统的报道却不多。本研究对在我院接受Haplo-HSCT的31例患者,选用我们通用的预处理方案和aGVHD预防措施,初步分析其移植后的造血植入情况,移植后6个月内aGVHD、感染及复发情况;并系统观察Haplo-HSCT前及移植后6个月内T细胞亚群细胞数量的变化及sjTREC数量、TCR-Vβ多样性、CD4+T细胞产生ATP数量,结合临床常规检查及病例特点,初步研究Haplo-HSCT后早期T细胞免疫重建规律及指标临床相关性。本研究可能为指导临床治疗的诸多细节,如免疫抑制剂的增减,移植后供者淋巴细胞输注(donor lymphocyte infusion,DLI)等提供一定的参考。
　　研究方法：
　　1、以临床常规使用的微量序列特异引物聚合酶链反应(sequence-specific primers PCR,PCR-SSP)技术进行HLA分型。
　　2、对于31例接受Haplo-HSCT的患者,采用我院常规的预处理和GVHD预防方案,选用G-CSF动员后的外周血和骨髓作为干细胞来源。
　　3、细胞标记分析:采用流式细胞术分析的方法,进行相关表面抗原及胞浆抗原阳性细胞检测。选用适宜的FITC,PE,APC或PerCP标记的单克隆抗体标记细胞,监测移植物中CD34+细胞比例,移植前后患者外周血中T细胞亚群比例,并根据血细胞分析中白细胞总数计算出T细胞各亚群细胞数绝对值。造血干/祖细胞标记为CD34+,初始T细胞的判定指标为CD4+/或CD8+/CD45RA+/CD62L+细胞;记忆T淋巴细胞(memory T lymphocyte,memory T,记忆T细胞)标记为CD4+/CD45RO+或CD8+/CD45RO+。调节性T细胞(regulatory T cell,Treg)标记为CD4+/CD25+/FOXP3+。
　　4、sjTREC测定:取病人外周血,密度梯度离心分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),提取基因组DNA。采用文献报道的引物,实时定量PCR检测患者信号结合T细胞受体删除环(signal-joint TRECs,sjTREC),了解患者胸腺输出功能。
　　5、T细胞受体(T cell receptor,TCR)谱系分析:取病人外周血,密度梯度离心分离单个核细胞,提取RNA。对于移植中出现aGVHD的6例患者,应用RT-RCR的方法扩增其移植前及移植后1个月、3个月的TCRVβ24个亚家族的序列,并通过基因扫描的方法了解其亚家族的克隆表达情况。
　　6、CD4+T细胞总体功能分析:采用ImmuKnow方法,按照试剂盒提供的步骤,免疫磁珠分离CD4+T细胞后,用植物血凝素(phytohem agglutinin,PHA)刺激,18小时后裂解细胞,测定细胞内ATP含量,以评估T细胞总体功能。依据ATP含量,将免疫反应分为高度(>525ng/mL)、中度(226–524ng/mL)和低度(<225ng/mL)三个水平。
　　7、统计学分析:使用SPSS.18软件进行Mann-Whitney检验、Spearman秩相关分析等统计学分析。
　　研究结果：
　　1、我们采用的静脉输注ATG体内去除T细胞的Haplo-HSCT方式,31例患者均未发生排斥。31例患者粒细胞植入中位时间为(17.16±4.75)d,27例患者血小板植入中位时间为(30.59±18.05)d,3例高危和1例标危患者至死亡血小板仍未植入;移植后100天内发生Ⅱ~Ⅳ度aGVHD13例(42%),其中Ⅲ~Ⅳ度3例(9.7%);移植后早期31例患者均有不同程度的感染,肺部感染13例(42%);31患者中死亡12人,其中7例死于复发,2例死于感染,2例死于急性GVHD。
　　2、移植前CD3+T细胞数为710±286.51/μL,移植后1个月降至372.85±313.52/μL,3个月升为1071.36±664.30/μL,6个月升至1393.32±857.89/μL。移植前CD4+T细胞数为277.24±124.49/μL,移植后1个月降至57.67±49.11/μL,3个月时升为178.04±148.93/μL,6个月升至210.19±130.74/μL;移植前CD8+T细胞平均值为396.36±210.23/μL,移植后1个月降至258.87±229.65/μL,3个月升为701.73±492.82/μL,6个月为升至879.11±566.40/μL;移植前CD4+CD45RA+CD62L+T细胞数为55.261±44.17/μL,移植后1个月降至1.95±2.72/μL,移植后3个月上升为4.69±5.62/μL,6个月升至23.08±37.04/μL;移植前CD8+CD45RA+CD62L+T细胞数为135.74±42.31/μL,移植后1个月为降至15.95±16.90/μL,3个月开始上升为70.57±47.61/μL,6个月升至176.09±222.18/μL。移植前CD4+CD45RO+T细胞数为203.61±101.44/μL,移植后1个月为46.56±42.08/μL,3个月为171.67±141.64/μL,6个月升至176.73±104.53/μL;移植前CD8+CD45RO+T细胞数为165.94±102.67/μL,移植后1个月为177.10±167.71/μL,3个月为523.23±415.34/μL,6个月升至437.63±410.09/μL;CD4+CD25+FOXP3+T细胞数为18.34±10.32/μL,移植后1个月为2.44±2.16/μL,3个月为9.84±11.12/μL,6个月为9.96±9.26/μL。
　　3、发生aGVHD组在监测时间点CD4+T和CD8+T细胞数略高于无aGVHD组,但差异无统计学意义;发生aGVHD组记忆T细胞和初始T细胞数高于无aGVHD组,但仅在移植后1个月时CD8+记忆T和CD8+初始T细胞间的差异有统计学意义。移植后1个月时,无aGVHD组Treg细胞数高于aGVHD组,其差异有统计学意义(P=0.0097)。
　　4、22例接受Haplo-HSCT的患者移植前外周血sjTREC水平为78.72149±135.0016拷贝/105PBMC,8例供者为699.4644±1221.6469拷贝/105PBMC,两者间差异有统计学意义(P<0.05)。22例患者移植后1个月sjTREC水平为20.0129±26.700拷贝/105PBMC,3个月为25.4031±29.7042拷贝/105PBMCs,6个月为21.5883±17.4021拷贝/105PBMC。患者移植前外周血sjTREC水平与移植后6个月内sjTREC水平无明显相关,Spearman相关系数分别为:0.278,0.467,0.714;相应的P值分别为:0.279,0.205,0.111。有aGVHD组与无aGHVD组移植后早期外周血sjTREC水平差异无统计学意义(P>0.05)。
　　5、1例健康供者TCRVβ24个亚家族的基因扫描图示亚家族完整、图型分布多符合高斯分布;6例患者移植前有较多的亚家族缺失,存在的亚家族谱系形态也不是高斯分布,较多出现双峰和寡克隆。患者移植后寡克隆比率呈逐渐增高趋势。
　　6、25例患者Haplo-HSCT前CD4+T细胞ATP含量为210.44±94.71ng/mL,移植后1个月降至181.87±121.63ng/mL,其后逐渐恢复,移植后3个月恢复至正常水平,为274.51±119.31ng/mL,移植后6个月升至336.50±98.63ng/mL。移植后发生肺部感染组的ATP值在移植前已经低于无肺部感染组,在移植后不同时间点也低于未发生感染者;发生aGVHD者在移植前的ATP值已经高于无aGVHD组,在移植后不同时间点也高于未发生aGVHD者;复发组在移植前和移植后不同时间组的ATP值均低于未复发组。
　　结论：
　　1、我们采用的静脉输注ATG体内去除T细胞,G-CSF动员的骨髓和外周血干细胞联合移植的单倍体相合造血干细胞移植的方式,无一例排斥,安全可行。aGVHD发生率与国内同行报道相似,复发感染是其主要死亡原因。
　　2、Haplo-HSCT术后CD8+T细胞数量恢复早于CD4+T细胞;记忆T细胞重建早于初始T细胞,尤其是CD4+初始T细胞,在移植后6个月时仍未恢复。Treg细胞数在Haplo-HSCT后恢复缓慢,移植后6个月时才仅恢复至移植前50%左右。aGVHD对移植后早期CD4+T和CD8+T细胞数无明显影响。Treg可能会抑制aGVHD的发生。
　　3、Haplo-HSCT前患者的胸腺输出功能已经受损,在移植后6个月,胸腺功能仍未恢复。aGHVD对移植后早期的外周血sjTREC水平无明显影响。
　　4、Haplo-HSCT前患者即存在TCRβV亚家族缺失和寡克隆,提示移植前患者处于免疫病理状态;6例发生aGVHD的患者,Haplo-HSCT后均存在亚家族的缺失和寡克隆的表达,且其寡克隆比率较移植前增高。可能与移植后时间较短,患者胸腺依赖途径的T细胞尚未免疫重建有关;也可能与aGVHD的发生及其治疗用了大剂量免疫抑制剂有关。
　　5、Haplo-HSCT后1个月时患者CD4+T细胞功能下降,移植后3个月时恢复正常;Haplo-HSCT后发生肺部感染和复发组病例的CD4+T细胞功能,在移植前后均低于无感染和复发组;而发生aGVHD组的ATP值在移植前后不同时间点均高于无aGVHD组。提示CD4+T细胞功能有可能预测感染复发及aGVHD的发生。

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英 文 缩 略 词

中文摘要

英文摘要

前言

一、Haplo-HSCT

二、Haplo-HSCT后早期T细胞的免疫重建

第一部分：单倍体相合造血干细胞移植术的临床研究

资料与方法

1．一般资料

2．预处理方案

3．aGVHD的诊断预防

4．出血性膀胱炎(haemorrhagic cystitis, HC)及肝静脉栓塞综合征（venous ocelusive disease, VOD）的预防

5．感染预防及支持治疗

6．供者选择及HLA配型及造血干细胞的动员采集及输注

7．造血干细胞的动员采集及输注

8．造血干细胞的植入指标

9．患者免疫功能检测

结果

1．植入情况

2．造血重建情况

3．移植后早期感染发生情况

4．aGVHD发生情况

5．复发情况

6．复发、移植相关死亡率及总体生存率

7．免疫重建情况：见第二部分

讨论

结论

第二部分 单倍体相合造血干细胞移植后早期T细胞免疫重建规律的初步研究

第一节：T细胞亚群细胞数量的重建

材 料 与 方 法

结果

讨论

结论

第二节： 胸腺近期输出功能

材 料 与 方 法

结 果

讨 论

结 论

第三节：T细胞受体谱系的克隆性分析

材 料 与 方 法

结 果

讨 论

结 论

第四节：T细胞功能的重建

材 料 与 方 法

结果

讨论

结论

参考文献

文献综述

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致谢