铜绿假单胞菌内在耐药性相关基因的筛选及研究

摘要

二十世纪五十年代后,由于持续不合理的使用抗生素,临床细菌的耐药性现在已经成为全球感染领域引人瞩目的问题之一。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)是一种革兰氏阴性条件致病菌,主要在临床中引起一定程度的感染。由于铜绿假单胞菌自身的特点:如细胞本身对抗生素的通透性低,形成生物被膜等,赋予了铜绿假单胞菌特有的内在抗药性。正是由于铜绿假单胞菌抗药性的出现,使得对于铜绿假单胞菌感染的治疗变得非常的棘手。因此,对于铜绿假单胞菌内在抗药性的研究就变得至关重要。
　　 为了寻找铜绿假单胞菌中与抗生素抗性相关的基因,我们构建了含有17000多个克隆的随机转座突变体库,并用不同类型的七种抗生素对转座突变体库进行了筛选。首先,在含有最小抑制浓度(Minimal Inhibitors Concentration,MIC)的固体平板上生长的转座突变体,被认为是抗性转座突变体。在1/2最小抑制浓度(MIC)的固体平板上不能生长的转座突变体被认为是敏感转座突变体。然后对固体平板筛选出来的转座突变体在液体培养基中重新进行一次筛选,并且确定每个转座突变体各自的最小抑制浓度(MIC)。最终通过随机PCR、测序和比对,确定了转座突变体库中的43个转座突变体的突变位点(即43个基因)。这些转座突变体与野生型的铜绿假单胞菌相比较至少对一种抗生素的敏感程度发生了3倍或者3倍以上的变化。还有一些转座突变体对三种抗生素都有3倍以上的变化,比如:PA4024、PA4342和PA4456的转座突变体。有两个转座突变体对羧苄青霉素的抗性提高了128倍。在这43个基因当中,现已经报道的与抗生素有关的基因有三个,他们是PA0424(编码多重耐药操纵子的抑制蛋白MexR)、PA0426(编码与抗生素抗性相关的RND外排泵的蛋白MexB；Resistance-Nodulation-CellDivision)和PA4207(编码与抗生素抗性相关的RND外排泵的蛋白).而其它基因并未见其与抗生素抗性有关的报道。
　　 铜绿假单胞菌中被预测为ABC转运器的蛋白很多。现在已经清楚的知道ATP依赖的ABC转运器在生物体中具有非常重要的作用。在我们筛选得到的结果中,PA4456被预测可能是ATP依赖的ABC转运器的组成部分,为了进一步确定其基因的功能,我们对其进行了深入的研究,如抗生素敏感性的测定,荧光分光光度法测定了细胞内四环素的积累等。结果表明:(1)PA4456基因在细胞对四环索和有机溶剂的转运过程具有重要的功能；(2)PA4456突变体对氯霉素(Chloramphenicol)、氨甲氧嘧啶(Trimethoprim)、环丙沙星(Ciprofloxacin)、二甲苯(Xylene)、二甲基甲酰胺(Dimethy-formamide)和甲苯(Toluene)的敏感性增加。
　　 为了了解其基因功能的调控机理,我们通过随机转座突变的方法从整个基因组水平筛选对PA44.56具有调节作用的基因,最终我们发现PA1180(phoQ)对PA4456具有潜在的抑制调节作用,在phoQ突变体中,PA4456的表达增加了8倍之多。
　　 总而言之,细菌抗性的出现是细菌本身改变自身调控网络的结果。而我们筛选得到的数据表明,在铜绿假单胞菌基因组当中,许多未知功能的基因或者参与细菌代谢和调控网络中的基因对细菌的耐药性都有着非常重要的作用。

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缩略表

第一章 绪论

1.1 抗生素及其功能

1.1.1 抗生素的定义及作用模式

1.1.2 抗生素的其它功能

1.2 病原菌抗药性的现状

1.3 铜绿假单胞菌

1.3.1 铜绿假单胞菌的特点及其致病性

1.3.2 中国临床中铜绿假单胞菌的现状

1.3.3 铜绿假单胞菌对抗生素的耐药机制

1.3.4 铜绿假单胞菌内在抗药性及研究的现状

1.4 本研究的目的、意义及主要研究的内容

第二章 实验材料和方法

2.1 材料

2.1.1 培养基和缓冲溶液

2.1.2 试剂

2.1.3 仪器

2.1.4 实验中用到的菌株和质粒

2.2 实验中使用的基本方法

2.2.1 细菌基因组DNA的提取

2.2.2 质粒的小量提取

2.2.3 大肠杆菌感受态细胞的制备

2.2.4 电转化

2.2.5 随机转座突变

2.2.6 与细菌耐药性有关的转座突变体的筛选

2.2.7 随机PCR、测序以及插入位点的确定

2.2.8 启动子报道载体的构建

2.2.9 铜绿假单胞菌电转化感受态细胞的快速制备

2.2.10三亲株杂交实验

2.2.11基因敲除实验(Gene Knockout)

2.2.12基因互补实验

2.2.13绿脓菌素(Pyocyanin)的测定

2.2.14细菌的丛动(Swarming)、泳动(Swimming)和蹭行运动(Twiching)

2.2.15荧光分光光度计法测量细胞内的四环素(Tetracycline)含量

2.2.16裂解法测定细胞内的Tet的含量

2.2.17平板抑菌圈法测定突变体对抗生素等的敏感性

2.2.18有机溶剂敏感性的测定

第三章 实验结果与讨论

3.1 随机突变体库的构建

3.2 随机突变体库的筛选以及突变体插入位点的确定

3.3 与运动性相关的突变体

3.4 PA4456基因功能研究

3.4.1 PA4456基因的相关信息

3.4.2 融合发光报道子的构建及受抗生素的调节情况

3 4.3 PA4456基因的敲除及互补

3.4.4 PA4456突变体中Tet的积累

3.4.5 有机溶剂敏感性的测定

3.5 寻找调节PA4456基因的调节基因

3.5.1 phoQ基因的敲除以及phoQ基因与PA4456基因的关系

3.6 phzA1与PA4456的关系确定

3.7 QS与PA4456的关系

结论

参考文献

攻读博士学位期间取得的科研成果

致谢

作者简介