黄花棘豆抗逆转录因子OoNAC72的克隆及功能初步分析

摘要

黄花棘豆作为中国西部草原地区的主要毒害草之一，给畜牧业和生态环境造成巨大损失和破坏。黄花棘豆优势分布区多为干旱少雨且寒冷的地区，其迅速蔓延与自身极强的抗逆性密切相关。因此，对其抗逆机理研究成为解析黄花棘豆蔓延机制的重要突破点。但目前研究主要集中在分布情况的调查统计、化感作用和毒理研究等方面，尚未触及抗逆机理研究。研究表明逆境胁迫下转录因子参与的转录调控对植物生长至关重要，而NAC转录因子又是植物特有的广泛参与各种逆境胁迫的重要转录因子。因此，本研究以NAC转录因子为切入点，充分利用已经获得的黄花棘豆转录组差异基因的数据，筛选出响应逆境胁迫关键NAC转录因子，并对其进行生物信息学分析、生物学特征分析、表达谱分析和功能验证等方面的研究，以明确其调控方式与途径，进而从转录调控层面来探究黄花棘豆的分子抗逆机制，以期为解析其蔓延的内在机制提供新的依据。
　　(1)根据黄花棘豆转录组测序数据分析及相关文献报道，确定注释为NAC转录因子的Unigene comp71824为研究目标。随后利用primer5软件设计特异引物，从黄花棘豆幼苗中成功克隆到该基因，命名为OoNAC72。OoNAC72基因序列全长1376bp，ORF为996bp，密码子起始位点在49bp位置，密码子终止位点在1045bp位置，编码331个氨基酸。利用NCBI的BlastX分析，结果显示黄花棘豆OoNAC72的N端含有一个长122(98～220)个氨基酸的NAM结构域，属于典型NAC转录因子。
　　(2)对克隆得到的黄花棘豆OoNAC72基因序列进行生物信息学分析，发现黄花棘豆OoNAC72蛋白不具有跨膜结构域，不存在信号肽，强亲水性极强，推测其定位在细胞核内。OoNAC72蛋白含有7个糖基化位点和19个磷酸化位点。和已知NAC家族蛋白比对发现该蛋白在NAM结构域高度保守，而NAM结构域以外的部分具有较高多态性，同时NAM结构域可以被分为A～E五个亚区域，进化树显示该蛋白与蒺藜苜蓿、鹰嘴豆相似度最高，亲缘关系最近。
　　(3)构建了pCAMBI1302-OoNAC72-eGFP植物融合表达载体，利用农杆菌介导烟草瞬时转化法进行对OoNAC72进行亚细胞定位分析，结果显示OoNAC72分布于烟草表皮细胞的细胞核中。同时，构建pGBKT7-OoNAC72酵母重组载体，通过酵母单杂交实验对OoNAC72转录因子进行转录激活活性分析，结果表明OoNAC72具有转录激活活性。整个生物学特征分析表明OoNAC72符合转录因子的基本特征。
　　(4)运用qRT-PCR方法对黄花棘豆OoNAC72基因在干旱、高盐、低温胁迫处理与脱落酸、乙烯、赤霉素三种激素处理下的表达谱进行分析，结果显示:干旱、高盐、低温非生物胁迫均可显著诱导OoNAC72基因的表达;激素处理下受脱落酸高效诱导表达，而乙烯和赤霉素处理对OoNAC72基因的表达影响不显著。结果表明，OoNAC72基因可能通过依赖ABA的信号途径参与黄花棘豆对逆境胁迫的应答反应。
　　(5)通过农杆菌介导的蘸花法遗传转化拟南芥(Col-0)，T1代转基因植株经潮霉素培养基的筛选，DNA水平上的检测，确定OoNAC72基因已经整合到拟南芥基因组中。收获得到具有抗性的T1代阳性转基因拟南芥植株种子，播种，获得T2代植株幼苗，即将开展后续相关试验。

目录

声明

摘要

第一章 绪论

1．1 黄花棘豆研究进展

1．1．1 黄花棘豆生物学特性

1．1．2 黄花棘豆分布与危害

1．1．3 黄花棘豆毒理研究

1．1．4 黄花棘豆化感作用研究

1．1．5 本课题组黄花棘豆相关研究

1．2 抗逆相关NAC转录因子研究现状

1．2．1 NAC转录因子

1．2．2 NAC转录因子的结构特点及其分类

1．2．3 NAC转录因子与逆境胁迫

1．3 研究目的及意义

1．4 研究内容与技术路线

1．4．1 主要研究内容

1．4．2 技术路线

第二章 黄花棘豆NAC转录因子基因的克隆和序列分析

2．1 实验材料与试剂

2．1．1 植物材料和菌株

2．1．2 主要试剂、酶与载体

2．1．3 实验仪器与设备

2．2 实验方法

2．2．1 各种溶液及培养基的配制

2．2．2 PCR引物设计

2．2．3 实验材料种植与处理

2．2．4 总RNA的提取(改良TRNzol法)

2．2．5 cDNA第一链合成

2．2．6 PCR反应

2．2．7 目的片段回收

2．2．8 回收产物与克隆载体的连接

2．2．11 菌落PCR

2．2．12 质粒提取与酶切验证

2．2．13 OoNAC72基因序列分析

2．3 结果与分析

2．3．1 黄花棘豆总RNA样品质量检测

2．3．2 目的基因片段的筛选与克隆

2．3．3 黄花棘豆OoNAC72基因生物信息学分析

2．3．4 OoNAC72与其他物种NAC蛋白序列同源性比较

2．3．5 黄花棘豆OoNAC72蛋白系统进化树分析

2．4 讨论

第三章 OoNAC72基因生物学特性分析

3．1 材料与试剂

3．1．1 实验材料

3．1．2 主要试剂

3．1．3 实验仪器与设备

3．2 实验方法

3．2．1 OoNAC72转录因子亚细胞定位分析

3．2．2 OoNAC72转录因子转录激活活性分析

3．3 结果与分析

3．3．1 OoNAC72转录因子亚细胞定位分析

3．3．2 OoNAC72转录因子转录激活活性分析

3．4 讨论

3．4．1 OoNAC72转录因子亚细胞定位讨论

3．4．2 OoNAC72基因转录激活活性讨论

第四章 非生物胁迫与激素处理下的表达谱分析

4．1 材料与试剂

4．2．1 qRT-PCR引物设计

4．2．2 RNA的提取与的cDNA第一链合成

4．2．3 qRT-PCR

4．3 结果与分析

4．3．1 黄花棘豆OoNAC72基因的熔解曲线分析

4．3．2 黄花棘豆OoNAC72基因非生物胁迫处理下的表达模式分析

4．3．3 黄花棘豆OoNAC72基因激素诱导下的表达模式分析

4．4 讨论

第五章 OoNAC72基因功能初步分析

5．1 材料与试剂

5．1．1 植物材料

5．1．2 主要试剂

5．1．3 实验仪器与设备

5．2 实验方法

5．2．1 农杆菌侵染转化拟南芥

5．2．2 转基因拟南芥DNA提取(改良CTAB法)

5．3 结果与分析

5．3．1 农杆菌转化

5．3．2 T1代转基因拟南芥阳性植株筛选

5．3．3 T1代转基因拟南芥阳性植株鉴定

5．3．4 T2代转基因拟南芥植株获取

5．4 讨论

结论与展望

参考文献

攻读硕士学位期间获得的科研成果

致谢