川金丝猴耳缘皮肤成纤维细胞特征化及向生殖系诱导的研究

摘要

金丝猴被列为我国Ⅰ级重点保护动物，同时也是我国第二国宝。由于其数量较少，国家出台了相关的法律条例如“森林法”以及“野生动植物保护条例”，并对此做了相关的宣传教育工作，但是川金丝猴依然存在不可忽视的生存压力。目前对川金丝猴的保护研究工作多是从生态学角度出发的宏观方法，关于细胞生物学方面研究相对较少。本研究旨在通过小分子化合物和组织提取液对川金丝猴皮肤成纤维细胞向生殖系细胞进行诱导。
　　(1)川金丝猴皮肤成纤维细胞的分离、培养与鉴定。细胞形态与成纤维细胞相符，传代后的川金丝猴皮肤成纤维细胞仍然具备良好的细胞活力。利用PCR、流式细胞技术对成纤维细胞以及间充质细胞表面标志基因及蛋白进行检测，标志基因prrx1、twist2、ddr2、runx2、vimentin表达，流式细胞技术检测川金丝猴皮肤成纤维细胞标志物结果发现CD29、CD90的表达量高，CD79等不表达，符合成纤维细胞的细胞类型。结果可以证明分离培养的细胞是成纤维细胞。
　　(2)利用Tranylcypromine、FSK、repsox、VPA、AM580、EP2004777、Chir99021小分子化合物处理细胞，发现细胞呈现旋涡状生长，部分从梭形变为圆形，对胚外内胚层标志性基因sall4以及gata6进行PCR与qPCR检测，发现其阳性表达，细胞诱导到6d-8d天时qPCR检测发现，gata6的表达水平显著性高于未经处理的对照组细胞(p＜0.05)，sall4的表达水平极显著高于对照组(p＜0.01)，说明细胞已经被小分子化合物诱导向胚外内胚层谱系细胞分化。
　　(3)利用小鼠睾丸组织提取液对小分子化合物处理后的细胞进行了进一步的诱导，诱导57d，在此期间对其进行形态学观察与基因表达检测。结果表明在组织提取液诱导细胞到15d时，vasa水平与sall4的水平都显著高于对照组(p＜0.05)。说明前一阶段诱导向胚外内胚层谱系分化的细胞经过小鼠睾丸组织提取液诱导后已经向着生殖谱系细胞分化。
　　综上所述，本研究成功分离培养了川金丝猴成纤维细胞，川金丝猴成纤维细胞经过小分子化合物与组织提取液诱导，诱导第一阶段小分子可以成功将川金丝猴皮肤成纤维细胞诱导向胚外内胚层谱系细胞分化，诱导第二阶段小鼠睾丸组织提取液可以成功将胚外内胚层谱系细胞诱导向生殖谱系细胞分化。

目录

声明

摘要

第一章 文献综述

1．1 川金丝猴研究现状

1．1．1 金丝猴生存压力

1．1．2 金丝猴的保护

1．2 小分子诱导细胞

1．2．1 Tranylcypromine

1．2．2 FSK

1．2．3 Chir99021

1．2．4 VPA作用机理

1．2．5 RepSox作用机理

1．2．6 AM580作用机理

1．2．7 EPZ004777作用机理

1．4 组织提取液诱导细胞分化

1．5 生殖细胞发育来源

1．6 本实验的研究意义与实验内容

第二章 金丝猴成纤维细胞的分离和培养

2．1 细胞

2．2 仪器和耗材

2．3 试剂

2．4 试剂配制

2．4．1 消化液配制

2．4．2 川金丝猴皮肤成纤维细胞培养基的配制

2．4．3 冻存液的配制

2．4．4 PBS的配制

2．4．5 双抗的配制(100×)

2．5 方法

2．5．1 川金丝猴成纤维细胞的分离

2．5．2 川金丝猴皮肤成纤维的传代

2．5．3 川金丝猴皮肤成纤维细胞的冻存与复苏

2．5．4 川金丝猴皮肤成纤维细胞的活力测定

2．5．5 数据统计

2．6 结果

2．6．2 川金丝猴皮肤成纤维细胞细胞活力测定

2．7 讨论和小结

第三章 金丝猴皮肤成纤维细胞特征化

3．1 细胞

3．2 仪器和耗材

3．3 试剂

3．4 相关试剂的配制方法

3．4．4 50ml川金丝猴皮肤成纤维细胞培养基的配制

3．5 方法

3．5．1 川金丝猴皮肤成纤维细胞总RNA的提取以及PCR

3．5．3 流式细胞仪检测川金丝猴皮肤成纤维细胞表面分子标记

3．6 结果

3．6．1 川金丝猴皮肤成纤维细胞基因表达

3．6．2 川金丝猴皮肤成纤维细胞表面分子标记特征测定

3．7 讨论和小结

第四章 川金丝猴皮肤成纤维细胞向胚外内胚层谱系细胞诱导

4．1 细胞

4．2 仪器和耗材

4．3 试剂

4．4 相关试剂的配制方法

4．4．1 小分子溶液的配制

4．4．2 1LPBS的配制

4．5．1 小分子诱导川金丝猴皮肤成纤维细胞

4．5．2 PCR以及qPCR检测川金丝猴皮肤成纤维细胞经诱导后基因表达

4．6 结果

4．6．1 川金丝猴皮肤成纤维细胞经小分子诱导后的细胞形态观察

4．6．2 PCR检测川金丝猴皮肤成纤维细胞经诱导后的基因表达

4．6．3 qPCR检测川金丝猴皮肤成纤维细胞经诱导后的基因表达

4．7 讨论与小结

第五章 小分子诱导后的细胞向生殖谱系细胞的诱导及检测

5．1 动物以及细胞

5．2 仪器和耗材

5．3 试剂

5．4 相关试剂的配制方法

5．4．1 组织提取液的配制

5．4．2 1LPBS的配制

5．4．3 50ml川金丝猴皮肤成纤维细胞培养液的配制

5．5 方法

5．5．1 组织提取液诱导川金丝猴皮肤成纤维细胞

5．5．2 PCR以及qPCR检测川金丝猴皮肤成纤维细胞经小分子以及小鼠睾丸组织提取液诱导后基因表达

5．6 结果

5．6．1 经小分子诱导后再用小鼠皋丸组织提取液诱导的细胞形态观察

5．6．2 PCR检测小分子诱导后再用小鼠睾丸组织提取液诱导的细胞基因水平

5．6．3 qPCR检测小分子诱导后再用小鼠睾丸组织提取液诱导的细胞基因水平

5．7 讨论与小结

结论

参考文献

附录

攻读硕士期间取得的科研成果

致谢