结核杆菌抗原Ag85B诱发抗肿瘤免疫应答及其机制研究

摘要

目的:通过对BCG Ag85B基因克隆、真核载体构建、转染B16细胞和其促增殖活性的研究,进一步探讨Ag85B在诱发抗肿瘤免疫应答中的作用,及其用于肿瘤免疫治疗的可行性研究.结论:(1)BCG和结核杆菌的Ag85B的碱基序列和氨基酸序列差别甚微,结核杆菌成功培养需要一个多月时间,培养条件和培养环境要求较严格,该研究Ag85B DNA的提取选用BCG,一方面BCG使用比较安全;另一方面BCG防疫部门有售,不需要培养结核分枝杆菌,节约时间.(2)该研究成功地从BCG中提取DNA并进一步扩增了Ag85B基因,鉴定了其序列的正确性,并且构建了重组pcDNA<,3>-Ag85B真核载体,转染B16细胞获得了阳性细胞克隆,用Western blotting鉴定在阳性细胞克隆内有Ag85B表达;此阳性细胞克隆对PPD<'+>人的PBMC具有较明显地促增殖活性,为Ag85B诱发抗肿瘤免疫应答及其机制的研究奠定了基础.(3)小鼠背部皮下接种B16细胞,8日后小鼠背部皮下再次分别接种相同数量B16细胞(对照组)、B16(pcDNA<,3>)细胞(对照组)和B16(pcDNA<,3>-Ag85B)细胞(试验组).结果为,13日内对照组和试验组小鼠血清中IFN-γ含量均有所上升,随后对照组小鼠血清中IFN-γ含量均呈现下降趋势,而试验组小鼠血清中IFN-γ含量则呈上升趋势;13日内对照组和试验组小鼠血清中IL-4含量均有轻微升高,随后逐步下降,两组小鼠血清中IL-4含量变化差异不明显.试验组小鼠血清中IFN-γ明显增高,而IL-4水平较低,显示出Ag85B诱发荷瘤小鼠Th1型细胞免疫应答,从而较有效抑制荷瘤小鼠体内的肿瘤生长,并且荷瘤小鼠生存时间也有较明显的延长.(4)小鼠尾静脉注射B16细胞,8日后再次分别注射相同数量经照射的B16(pcDNA<,3>)细胞(对照组)和经照射的B16(pcDNA<,3>-Ag85B)细胞(试验组).结果为,对照组小鼠在第18日肺部开始出现2个肿瘤结节,在第23日肺部出现6个直径3mm的肿瘤结节;而试验组小鼠在第18日肺部未出现肿瘤结节,在第23日肺部出现2个直径3mm的肿瘤结节.试验结果显示出Ag85B对小鼠肺部转移肿瘤治疗也有一定的疗效.上述Ag85B诱发抗肿瘤免疫应答初探性研究结果显示出Ag85B在抗肿瘤免疫治疗中的应用前景.

目录

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符号说明

前 言

第一部分Ag85B表达载体pcDNA3-Ag85B的构建、转染及其活性检测

一.材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二.实验结果

1.Ag85B基因序列特异性引物的设计

2.BCG中提取DNA及其扩增Ag85B基因

3.Ag85B克隆载体的构建

4.Ag85B真核重组载体的构建

5.Ag85B测序结果

6.重组质粒的大量提取及纯化

7.脂质体转染条件的优化

8.阳性克隆筛选及鉴定

9.Western blotting分析

10.B16(pcDNA3-Ag85B)细胞的促增殖活性分析

三.讨论

四.小结

第二部分结核杆菌抗原Ag85B转染肿瘤细胞抗肿瘤免疫应答及其机制研究

一.材料和方法

(一)实验材料

(二)实验方法

二.实验结果

1.小鼠背部皮下荷瘤体积结果

2.小鼠肺部转移肿瘤结果

3.荷瘤小鼠生存分析

4.IFN-γ测定结果

5.IL-4测定结果

三.讨论

四.小结

参考文献

抗原85复合物研究进展

待发表论文

致谢