FUT3靶向miRNA表达载体的构建及其在胃癌基因治疗中的实验研究

摘要

背景： 多年研究发现Lewis血型抗原表达于消化道上皮组织表面并与幽门螺杆菌(HP)引起胃癌的发病机制密切相关。Lewis血型抗原中Leb可与HP的BabA特异结合，是HP粘附的主要受体之一。实验证明含Leb的可溶性糖蛋白或抗Leb的抗体能抑制Hp黏附于胃上皮细胞。Leb的表达受Le(FUT3)基因和Se(FUT2)基因的共同调控，两种基因表达的变化会影响到Leb抗原的合成。 本研究将从FUT3基因入手，以较高表达Lewis血型抗原的胃癌细胞系KATO-Ⅲ为研究对象，通过RNAi技术中的miRNA干涉α-1，3/4-岩藻糖基转移酶(即FUT3酶，由FUT3基因编码)的合成和表达，研究其降低胃癌细胞Leb的表达从而抑制HP对胃上皮细胞的黏附的作用，并观察FUT3基因沉默对胃癌细胞的增殖和凋亡的影响。本课题的研究将有利于探讨肿瘤等重大疾病的发病机制，为肿瘤的靶向基因治疗提供新的思路和手段。 目的： 本研究旨在利用RNAi技术，构建FUT3基因的miRNA干扰质粒pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miR;通过体外试验探讨FUT3的miRNA干扰质粒抑制胃癌细胞系KATO-Ⅲ的Lewis抗原表达及肿瘤细胞生长的作用机理，以期为胃癌治疗提供新的基因治疗手段，同时为获得FUT3基因的最佳miRNA序列应用于临床胃癌提供实验基础。 方法： 1)选择2个符合条件的靶向FUT3的miRNA序列，分别体外合成两段互补的寡核苷酸，与线性载体pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miREXPRESSIONVECTOR连接；确定构建成功后，转染KATO-Ⅲ细胞； 2)将脂质体/质粒载体以不同剂量及浓度配比转染KATO-Ⅲ细胞，荧光显微镜观察转染效率，筛选出最佳阳离子脂质体/质粒载体配比； 3)质粒转染肿瘤细胞48小时后，RT-PCR法检测FUT3基因在mRNA水平的变化;应用免疫细胞化学法、流式细胞术检测Lewis抗原表达变化；筛选出FUT3的最佳miRNA序列。 4)用筛选出的FUT3miRNA转染KATO-Ⅲ细胞，MTT实验、流式细胞术(AnnexinV/PI双染色法)检测FUT3基因的表达抑制对KATO-Ⅲ细胞生长的影响及诱导凋亡作用。 结果： 1)基因测序结果表明插入片段的序列与合成的FUT3寡核苷酸序列完全相符，即成功构建针对FUT3基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP-FUT3-miR表达载体。 2)筛选出最佳的阳离子脂质体/质粒载体转染复合物的配比为8μl:2μg。 3)RT-PCR结果表明在mRNA水平上所构建的两个质粒都可抑制FUT3基因的表达；免疫细胞化学法、流式细胞术结果显示所构建的质粒均可抑制Leb抗原水平的表达。与空载体对照相比，pcDNATM6.2-FUT3-miRNA2比pcDNATM6.2-FUT3-miRNA1抑制效果更明显。 4)MTT实验表明FUT3基因的表达减少能明显抑制KATO-Ⅲ的生长；用流式细胞术(AnnexinV/PI双染色法)检测发现抑制了FUT3基因表达后，可诱导肿瘤细胞的凋亡。 结论： 本课题成功构建了针对人FUT3基因的miRNA干扰载体。实验证明，利用RNAi技术能有效地抑制KATO-Ⅲ胃癌细胞系FUT3基因mRNA的表达，并能降低该肿瘤细胞Lewis抗原的生物合成；FUT3基因miRNA干扰载体对KATO-Ⅲ细胞的生长和凋亡也有不同程度的影响。本课题为探讨FUT3基因在Lewis抗原相关胃癌基因治疗方面的应用奠定了理论基础。

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文摘

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论文说明：符号说明

声明

研究生导师和课题指导小组成员价绍

前言

材料和方法

结果

讨论

结论

参考文献

综述 Lewis抗原在HP引起胃癌上的研究进展

攻读学位期间发表的学术论文

致谢