HL-60细胞诱导分化过程中NM23表达变化及其分子调控机制的研究

摘要

背景： 急性髓细胞性白血病(Acutemyeloidleukemia，AML)是一种严重危害人类健康的造血干细胞恶性克隆性疾病，大量未成熟髓细胞分化停滞、广泛增殖，白血病细胞，增生积聚、浸润其他组织器官，而正常造血受到抑制。根据阻滞阶段的不同分为几种亚型，常见的是M1-M5型。传统的大剂量联合化疗虽然能使许多患者达到完全缓解，但具有胃肠道不适、骨髓抑制、肝肾功能损害等副作用，化疗后骨髓抑制期易并发感染或DIC，引起早期死亡，多次化疗产生的耐药性也容易导致复发，因此，需要研发新的高效安全药物，并配合其他方法综合治疗。 自Leosachs提出恶性肿瘤细胞可以转化为较成熟细胞以来，肿瘤诱导分化疗法成为人类治疗恶性疾病最为理想的方法之一。我国学者相继首创全反式维甲酸(ATRA)和三氧化二砷(As2O3)治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)，并且获得成功。上述两种诱导分化剂的安全与有效应用，极大的鼓舞和推动着国内外学者从细胞分化调控的不同角度去探讨新型诱导分化剂。首先在中药单体研究方面发现甙类、多糖类、胆酸盐类、有机酸类、甾醇类对白血病细胞均具有诱导分化作用。其次是组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACIs)发展较快，能够诱导多种类型的白血病细胞分化，其主要机制在于白血病细胞由于染色体易位等造成异常蛋白表达，引起组蛋白过度去乙酰化，而使基因转录受抑制，阻止白血病细胞分化的发生。因此，抑制HDAC活性，阻止组蛋白的去乙酰化，就可以诱导组蛋白的高乙酰化状态，促进转录因子与DNA结合，受抑基因得到表达，从而促进分化。但是，到目前为止，除了ATRA和As2O3成功用于急性早幼粒细胞白血病(APL)外，单独的上述每种诱导分化剂均没有取得令人鼓舞结果。更多的是倾向于不同诱导分化剂之间的联合应用。因此，诱导分化剂的联合使用将成为肿瘤细胞诱导分化治疗的新途径，而不同诱导分化剂具体作用分子机制或关键靶位的确定，是影响高效诱导分化剂筛选和不同诱导分化剂有效组合的重要环节。但是，如何选择研究的切入点成为能否揭示关键机制的重要环节。 nm23基因，1988年由美国国立癌症研究所的steeg发现，并发现它的高表达往往与肿瘤的转移能力呈反比，遂将此基因命名为nm23基因(non-metastasis编号为23的cDNA基因克隆)，随着对nm23基因研究的不断深入，发现nm23的表达水平、基因缺失、突变与肿瘤的发生、发展、转移及预后有着非常复杂的关系。有报道指出未分化的髓细胞性白血病细胞能产生一种分化抑制因子，其中一种在急性髓细胞性白血病小鼠血浆中被提取、纯化，并被证明是nm23基因的同系物。近年来的临床研究中发现nm23基因在AML中的表达水平高低和患者的预后有着明显的反变关系。nm23基因家族已发现9个成员，但和肿瘤的的生物学特性关系较密切的是nm23-H1、nm23-H2。nm23-H1它编码一种磷酸二核酸激酶(NDPK)的亚基，nm23蛋白可能可能通过NDPK一致或相似的途径调节细胞信号传递、细胞分化等过程。NDPK分布较广，它可通过乒乓机制介导二磷酸与三磷酸核苷的相互转化，从而维持细胞内GTP池的平衡，影响细胞内的信号传到途径，调节细胞的增殖和分化。nm23-H2蛋白也就NDPKB，与c-myc基因的一种转录因子高度同源，该转录因子为一种嘌呤结合因子，它可通过与c-myc基因调节区域结合而促进其转录，调控c-myc及细胞生长相关基因的转录而调节白血病细胞的分化状态。上述研究结果均提示nm23基因有可能成为新型的诱导分化靶点。 目的： 本实验在以上研究背景的基础上，以人急性早幼粒细胞白血病HL-60细胞株为研究对象，建立曲古霉素A和淫羊藿甙诱导分化模型，观察诱导前后细胞增殖分化的改变，以及nm23-H1、nm23-H2基因在mRNA水平的表达变化，研究nm23在诱导分化过程中的表达变化，及其对下游G-CSF和c-myc基因表达的调控作用，探讨上述不同来源诱导分化剂作用的关键分子机制，以及nm23基因作为诱导分化靶点的可能性。 方法： 取对数生长期的HL-60细胞，分别加入终浓度为0.2μmol/l的曲古霉素A(TSA)、200μg/ml的淫羊藿甙(ICA)，于37℃、5％CO2饱和湿度下培养1至3天，瑞氏染色观察细胞形态，MTT法检测细胞增殖变化，NBT还原实验测定细胞分化状态，流式细胞术检测细胞表面CD11b表达及细胞周期变化，RT-PCR检测nm23-H1、nm23-H2、G-CSF、c-myc基因在mRNA水平的表达变化。每组实验重复三次，以0.1％乙醇为溶剂对照组，以RPM1640为空白对照组。 结果： 曲古霉素A、淫羊藿甙作用后，HL-60细胞的增殖均受抑制，NBT还原率增加，CD11b抗原表达升高，表明药物产生诱导分化作用。nm23-H1、nm23-H2、c-myc基因表达均有不同程度地降低，G-CSF基因表达增强。其中，曲古霉素A作用最明显。做相关分析表明，nm23-H1、nm23-H2基因与G-CSF基因表达呈明显负相关关系，与c-myc基因表达呈正相关关系。 结论： 本实验研究结果提示曲古霉素A、淫羊藿甙单独作用与HL-60细胞能抑制其增殖，促进其向成熟分化。曲古霉素A、淫羊藿甙的半数抑制浓度分别为0.2μmol/l、200μg/ml。TAS、ICA的诱导分化的作用可能足通过下调nm23-H1、nm23-H2基因，进而提高G-CSF表达、抑制c-myc基因表达来实现的。该结果在一定程度上揭示了曲古霉素A、淫羊藿甙的作用机制，并为发展以nm23为靶点的诱导分化疗法提供了实验依据。

目录

文摘

英文文摘

论文说明：主要符号说明

声明

研究生导师及课题小组成员简介

前 言

1. 材料与方法

1.1 主要材料仪器

1.2细胞培养及药物处理

1.3细胞形态学观察

1.4细胞增殖检测

1.5细胞分化检测

1.6细胞周期检测

1.7半定量RT-PCR检测nm23-H1、nm23-H2、G-CSF、c-myc基因mRNA表达

1.8统计学处理方法

2.结果

2.1 TSA、ICA对HL-60细胞形态的影响

2.2 TSA、ICA抑制HL-60细胞增殖

2.3 TSA、ICA促进HL-60细胞分化

2.4 TSA、ICA对细胞周期的影响

2.5 TSA、ICA作用后HL-60细胞中nm23-H1、nm23-H2、G-CSF、c-myc mRNA表达的变化

附图1

附图2

3.讨 论

4结论

参考文献

【附件】

综述1 Nm23(转移抑制基因)基因的研究进展

综述2 粒细胞集落刺激因子的研究概况

攻读硕士学位期间发表文章

致谢