大柴胡汤和桂附地黄方的化学成分指纹图谱研究

摘要

质量控制是影响中药现代化发展的关键问题，由于中药成分复杂，就要求建立的中药质量标准既是全面的、整体的，又是有层次的，指纹图谱就是这样一种表达中药复杂体系的合适的整体表征模式。
　　1、大柴胡汤的化学成分指纹图谱研究
　　大柴胡汤是我国中药的传统名方，由柴胡、芍药、半夏、生姜、大枣、枳实、黄芩、大黄八味药组成。据《伤寒论》所述，取柴胡24g、黄芩9g、清半夏9g、白芍9g、枳实12g、干姜15g、大黄6g和大枣4枚，加水2400mL，武火煮沸后文火煎煮直至浓缩到1200mL，弃去药渣，继续煎煮浓缩至600mL。得到汤剂后，70％乙醇沉淀处理，得到大柴胡汤70％乙醇和粗多糖两个部位。
　　大柴胡汤70％乙醇部位样品经冷冻干燥后，用50％甲醇溶解，进行HPLC分析，经过条件的摸索、方法学验证，最终建立了大柴胡汤70％乙醇部位的HPLC指纹图谱。随后，通过对比单味药材的HPLC图，对大柴胡汤中特征色谱峰的来源进行了确认，并运用(I)on Trap LC/MS技术对25个特征色谱峰中的16个进行了指认，指认结果包括芍药苷、橙皮苷、黄芩苷、柴胡皂苷A等主要有效成分。
　　对于大柴胡汤粗多糖部位，我们进一步采用“TFA全水解-PMP柱前衍生化-HPLC检测”的方法建立了大柴胡汤多糖部位指纹图谱，并通过与标准品比对，对各个色谱峰进行了指认。
　　为了进一步对大柴胡汤进行质量研究，达到从源头上的有效监控，我们建立了枳实、枳壳、大黄的70％乙醇部位化学成分指纹图谱，运用Ion Trap LC/MS技术对主要色谱峰进行了指认，并结合市售的中药饮片，做了相应的分析和评价。得到如下结论:1、市售枳实、枳壳多数产自山西，虽然产地一样，但从化学成分指纹图谱中可以发现，某些市售枳实缺失柚皮苷和新橙皮苷两个主要黄酮类成分，这正是枳实中重要的功效部位，而《中国药典》中以辛弗林作为枳实的检测指标，这种单一指标法是无法将此类枳实鉴别出来的;2、枳实、枳壳是在宋代以后才被明确区分，虽药效有所差异，但它们的化学成分基本一致，二者的指纹图谱相似度非常高，相似度软件无法区分，通过实验验证，运用系统聚类分析、主成分分析两种数据分析方法可以将枳实、在一定程度上区分开来;3、市面上所售的大黄多来自于甘肃和青岛，它们的化学成分指纹图谱稳定且相似度非常高，但在我们鉴定的所有样品中，有一组因多出个别较大的色谱峰而被与其他样品区分开，《中国药典》以大黄中芦荟大黄素、大黄酸、大黄酚以及大黄素甲醚的总含量来作为大黄的质量控制指标，这种方法很难将此类样品检测出来。从以上结果可以看出，在对大柴胡汤进行质量控制的过程中，单味药的选取和监控也十分重要。
　　2、桂附地黄方的化学成分指纹图谱研究
　　桂附地黄方由熟地黄、山药、山茱萸、茯苓、泽泻、丹皮、附子（制）、肉桂八种单味药材以8∶4∶4∶3∶3∶3∶1∶1的比例制成。桂附地黄方的剂型除了最常见的丸剂（包括水蜜丸和浓缩丸）外，还有口服液、胶囊等，虽然剂型不同，但复方组成基本一致。市面上所售的桂附地黄方类药物多是以马钱苷和丹皮酚含量作为它们的质量控制指标，这种方法很难反映中药的整体性和复杂性。因此我们建立了桂附地黄方化学成分的指纹图谱，试评价市售桂附地黄丸的质量。
　　桂附地黄方生药粉碎处理后，考察不同溶剂的提取，最终选择无水乙醇作为桂附地黄方的提取溶剂，有两点原因:一是以无水乙醇作为提取溶剂，提取率高，提取的化学成分更为完全;二是对于市售的丸剂，以无水乙醇作为提取溶剂可使提取物受辅料的影响最小。得到无水乙醇提取液后，为了尽可能地避免前处理对其化学成分的影响，我们将提取液蒸干复溶后直接进行HPLC分析，建立了桂附地黄方乙醇部位化学成分指纹图谱。通过对比单味药材的色谱图，对其中主要色谱峰的来源进行了确认，并运用Ion Trap LC/MS技术确认了其中6个色谱峰。
　　桂附地黄方的丸剂是市面上最为常见的药物之一，临床应用也十分广泛，在已建立的指纹图谱基础上，我们对10家药厂所售的10个桂附地黄浓缩丸样品进行了质量评价。通过相似度计算、系统聚类分析和主成分分析对数据进行处理，我们可以得到结论:总体上来看，市售桂附地黄丸与传统桂附地黄方质量一致性良好，但市售桂附地黄丸之间、市售桂附地黄丸与桂附地黄方之间存在不同程度的差异，这种情况可能与单味药材来源不同、工厂大规模生产工艺不同等有关。
　　桂附地黄方生药粉碎处理后，用乙醇对水提取液进行沉淀，制得桂附地黄丸方粗多糖部位，进一步采用“TFA全水解-PMP柱前衍生化-HPLC检测”的方法建立了桂附地黄方多糖部位指纹图谱，并通过与标准品比对，对各个色谱峰进行了指认。同样的，我们也在此基础上对10家药厂所售的10个桂附地黄浓缩丸进行了质量评价。通过一系列的数据处理得到结论:市售桂附地黄丸与桂附地黄方的多糖组成质量一致性很好，且市售桂附地黄丸的多糖质量也非常稳定。
　　3、总结
　　本文中所建立的指纹图谱均是提取了一段波长的色谱峰，可以在一张谱图上得到该波长范围内所有物质的最大吸收峰，该方法弥补了单波长测定指纹信息少、多波长测定图谱表征不方便的不足，避免了多波长指纹图谱融合技术所造成的误差，这在以往的指纹图谱相关文献中未见报道。
　　本文建立了大柴胡汤、枳实、枳壳、大黄、桂附地黄方的化学成分指纹图谱，并在此基础上采用多种数据处理方法对市售的枳实、枳壳、大黄、桂附地黄丸进行了整体评价，得到了科学、详尽的结果，说明指纹图谱可以作为一种质量评价依据。不仅如此，指纹图谱技术还可以应用到药材的生产、加工、贮存各个环节，以及复方制剂的原料、中间品、成品、流通产品中，便于及时发现质量的变异和缺陷，避免不合格产品流入市面。

目录

声明

缩略词表

摘要

第一章 前言

1．1 中药质量控制的重要性

1．2 指纹图谱在中药质量控制中的应用

1．2．1 中药质量控制现状

1．2．2 中药指纹图谱技术的发展和应用

1．2．3 色谱-质谱联用技术在中药指纹图谱中的应用

1．2．4 不同评价方法在中药指纹图谱中的应用

1．3 大柴胡汤和桂附地黄方的研究概况

1．3．1 大柴胡汤的研究概况

1．3．2 桂附地黄方的研究概况

1．4 本课题的研究目的和思路

第二章 大柴胡汤70％乙醇部位HPLC指纹图谱研究

2．1 引言

2．2 实验材料

2．2．1 仪器

2．2．2 试剂

2．3 实验方法

2．3．1 供试品溶液的制备

2．3．2 色谱条件优化

2．3．3 色谱条件

2．3．4 质谱条件

2．4 实验结果

2．4．1 大柴胡汤70％乙醇部位供试品溶液的指纹图谱

2．4．2 大柴胡汤70％乙醇部位特征色谱峰的可能来源确认

2．4．3 大柴胡汤HPLC指纹图谱中特征峰的定性鉴别

2．4．4 方法学考察

2．5 讨论

第三章 大柴胡汤多糖部位HPLC指纹图谱研究

3．1 引言

3．2 实验材料

3．2．1 仪器

3．2．2 试剂

3．3 实验方法

3．3．1 供试品溶液的制备

3．3．2 色谱条件

3．4 实验结果

3．4．1 大柴胡汤多糖部位指纹图谱的建立与特征峰的指认

3．4．2 方法学考察

3．5 讨论

第四章 枳实、枳壳70％乙醇部位HPLC指纹图谱研究

4．1 引言

4．2 实验材料

4．2．1 仪器

4．2．2 试剂

4．3 实验方法

4．3．1 枳实70％乙醇部位供试品溶液的制备

4．3．2 色谱条件的优化

4．3．3 色谱条件

4．3．4 质谱条件

4．4 实验结果

4．4．1 枳实、枳壳70％乙醇部位HPLC指纹图谱的建立

4．4．2 枳实HPLC指纹图谱中特征峰的定性鉴别

4．4．3 方法学考察

4．4．4 14个不同来源枳实、枳壳样品70％乙醇部位指纹图谱的建立

4．4．5 不同来源枳实、枳壳70％乙醇部位指纹图谱的评价方法

4．5 讨论

第五章 大黄70％乙醇部位HPLC指纹图谱研究

5．1 引言

5．2 实验材料

5．2．1 仪器

5．2．2 试剂

5．3 实验方法

5．3．1 大黄70％乙醇部位供试品溶液的制备

5．3．2 色谱条件优化

5．3．3 色谱条件

5．3．4 质谱条件

5．4 实验结果

5．4．1 大黄70％乙醇部位指纹图谱的建立

5．4．2 大黄HPLC指纹图谱中特征峰的定性鉴别

5．4．3 方法学考察

5．4．4 13个不同来源大黄样品70％乙醇部位指纹图谱的建立

5．4．5 13个不同来源大黄样品70％乙醇部位指纹图谱的评价方法

5．5 讨论

第六章 桂附地黄方乙醇部位HPLC指纹图谱研究

6．1 引言

6．2 实验材料

6．2．1 仪器

6．2．2 试剂

6．3 实验方法

6．3．1 不同提取溶剂的考察

6．3．2 供试品溶液制备

6．3．3 色谱条件优化

6．3．4 色谱条件

6．3．5 质谱条件

6．4 实验结果

6．4．1 桂附地黄方乙醇部位供试品溶液的指纹图谱

6．4．2 桂附地黄方乙醇部位特征色谱峰的可能来源确认

6．4．3 桂附地黄方HPLC指纹图谱中特征峰的定性鉴别

6．4．4 方法学考察

6．4．5 10个不同来源桂附地黄丸样品乙醇部位指纹图谱的建立

6．4．6 不同来源桂附地黄丸乙醇部位指纹图谱的评价方法

6．5 讨论

第七章 桂附地黄方多糖部位HPLC指纹图谱研究

7．1 引言

7．2 实验材料

7．2．1 仪器

7．2．2 试剂

7．3 实验方法

7．3．1 供试品溶液的制备

7．3．2 色谱条件

7．4 实验结果

7．4．1 桂附地黄方多糖部位指纹图谱的建立与特征峰的指认

7．4．2 方法学考察

7．4．3 传统桂附地黄方与市售桂附地黄丸多糖部位指纹图谱的评价方法

7．5 讨论

第八章 结语

参考文献

文献综述 中药指纹图谱及其在质量评价中的应用

发表文章

作者简介

致谢