金荞麦提取物抑制黑色素瘤细胞穿越内皮单层的机制研究

摘要

黑色素瘤是近几年发病率增长较快的恶性肿瘤之一。与其它癌症相比，黑色素瘤发病年龄相对年轻，易转移，对化学治疗和放射治疗不敏感，预后差。其中转移是黑色素瘤的特点之一，是造成预后差的主要因素。控制转移是决定黑色素瘤患者预后的关键因素。开发针对转移过程和微小转移灶的抗恶性肿瘤药，是提高肿瘤治愈率、降低复发和死亡率、延长患者生存期的重要途径。但是目前临床上尚缺乏有效地抗肿瘤转移的药物，而传统的中药在抗肿瘤转移治疗方面展示了良好的应用潜能。
　　 肿瘤的侵袭转移是个多因素，多步骤的过程。多伦多大学Siu教授课题组发现，在黑色素瘤细胞穿越内皮单层的过程中，细胞膜表面的N-cadherin表达上调和E-cadherin表达下调。同时发现Src的活化增加，由此导致N-cadherin胞内段磷酸化增加，致使β-catenin与N-cadherin胞内段解离增加，胞内游离的β-catenin增加，进入细胞核内参与基因的转录。人为阻断上述任意一个环节，都可不同程度的抑制黑色素瘤细胞穿越内皮单层。
　　 金荞麦为多年生草本植物，其提取物在中国民间用以治疗肺脓疡及肺癌等。近年来我国学者发现其具有抗癌活性，对化学致癌物二甲基苯葸(DMBA)和巴豆油诱发的小鼠皮肤乳头状瘤显示明显的抑制作用。新近利用活性追踪法从金荞麦根中分离出一种抗癌活性很高的原花色素缩合性单宁混合物，总单宁含量为67％，体内试验发现这种金荞麦提取物能明显抑制小鼠黑色素瘤细胞（B16细胞）的自发性肺转移，体外实验也证实其具有明显的抗肿瘤转移作用，本研究拟从黏附分子角度探讨其抑制黑色素瘤侵袭转移可能的机制。
　　 方法和结果
　　 1.苏木素染色法测定贴壁细胞增殖活性方法的建立
　　 在使用传统MTT比色法和CCK-8比色法测定金荞麦提取物对黑色素瘤细胞和内皮细胞的毒性作用时，我们发现上述方法无法客观的反映药物的作用。因为金荞麦提取物与四甲基偶氮唑盐及其衍生物发生反应，干扰了显色，实验结果与显微镜下所见完全相反。同时传统的染色法测定细胞增殖由于对培养板非特异吸附严重，而致使其准确性和重复性较差。
　　 苏木素(Hematoxylin)是一种天然染料，可用于生物组织切片细胞核染色，其特点是仅使细胞核着色，细胞核碎裂溶解后不着色。本研究首先将苏木素染色法用于贴壁细胞系体外增殖活性的检测，并与MTT法、CCK-8法进行比较，结果发现其三种方法的检测结果具有一致性。我们将苏木素染色法用于检测中药提取物、化疗药物及细胞毒性细胞对贴壁细胞的毒性作用。结果显示，苏木素染色法各项实验的检测结果敏感、特异，经济，重复性好。
　　 2.筛选合适的金荞麦提取物浓度
　　 应用苏木素染色法测定金荞麦提取物对黑色素瘤细胞(WM239)和脐静脉内皮细胞(HUVEC)的毒性作用，寻找既对细胞有作用又不引起细胞死亡的合适的浓度区间和时间点。结果表明当金荞麦提取物浓度不高于100μg/ml，24小时内药物对两种细胞的增殖没有明显的抑制作用；但高于100μg/ml，或是超过24小时金荞麦提取物对细胞增殖的抑制作用和毒性作用就逐渐表现出来了。
　　 3.金荞麦提取物对WM239细胞侵袭及迁移活性的影响
　　 利用transwell小室在体外建立迁移模型，观察不同浓度的金荞麦提取物是否能抑制黑色素瘤细胞的迁移活性。实验结果表明，随着金荞麦提取物浓度的升高，迁移到下室中的WM239细胞逐渐减少，明显抑制WM239细胞的迁移活性。
　　 4.金养麦提取物对HUVEC和WM239细胞共培养体系N-cadherin表达的影响
　　 用不同浓度的金荞麦提取物干预黑色素瘤细胞和内皮细胞的共培养体系，然后应用流式细胞仪测定共培养体系中黑色素瘤细胞表面N-cadherin表达量的变化，观察金荞麦提取物是否影响对N-cadherin的表达量。实验结果显示，金荞麦提取物浓度在100μg/m1以下时对黑色素瘤细胞WM239膜表面黏附分子N-cadherin的表达量没有明显的抑制或是促使其降低的作用。
　　 5.金荞麦提取物对N-cadherin胞内段磷酸化及其与β-catenin结合的影响
　　 用不同浓度的金荞麦提取物干预黑色素瘤细胞和内皮细胞的共培养体系，收集细胞，提取细胞总蛋白，运用免疫沉淀技术从总蛋白中分离得到N-cadherin蛋白。然后利用Westernblot技术探测其胞内段磷酸化的情况以及与N-cadherin连接的β-catenin的量。实验结果表明，从12.5μg/ml～100μg/ml的浓度区间里，胞内段磷酸化的蛋白条带灰度值比值随着金荞麦浓度的升高而逐渐降低，表明N-cadherin胞内段磷酸化的量随浓度升高而逐渐减少。N-cadherin胞内段连接的β-catenin量逐渐增多。
　　 6.金荞麦提取物对Src活化的影响
　　 用不同浓度的金荞麦提取物干预黑色素瘤细胞和内皮细胞的共培养体系，收集细胞，提取细胞总蛋白。然后利用Westernblot技术检测Src的活化型P-Src蛋白的表达情况。实验结果显示100μg/ml～12.5μg/ml的浓度区间里，P-src的蛋白条带的颜色逐渐变浅，与各自内参灰度值的比值呈下降趋势。
　　 结论
　　 1.建立了苏木素染色法测定贴壁细胞增殖活性的方法。该法与其它方法相比，具有经济、简便、重复性和准确性较好等优点。
　　 2.金荞麦提取物合适的实验浓度为不高于100μg/ml，由此我们选定的实验组浓度分别为100μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、12.5μg/ml.
　　 3.金荞麦提取物明显抑制黑色瘤细胞WM239的迁移活性，药物抑制率与药物浓度呈正相关。
　　 4.金荞麦提取物对黑色素瘤细胞膜表面N-cadherin表达量几乎没有影响，但是药物可降低Src蛋白的活化水平，减少了N-cadherin胞内段的磷酸化，致使N-cadherin与β-catenin的解离减少。