以鼠疫菌为模型的重要致病菌基因组多态性数据库的构建及应用研究

摘要

传染病肆虐人类的历史不下数千年。近三十年来，全球范围内面临着“新传染病不断出现，旧传染病死灰复燃”的严峻挑战，传染病仍然是世界范围内引起人类死亡的首要原因，每年因传染病死亡的人数超过1300万。鼠疫和结核等老传染病仍严重威胁着人类的健康，而在与人类斗争过程中，致病菌也不断进化，已演化出诸如O157∶H7大肠杆菌和多重耐药结核杆菌等新基因型和耐药的致病菌株。细菌长期的进化过程中积累了大量突变，而使基因组呈现出及极其复杂的多样性。在致病菌中，这种突变导致了新致病相关基因和耐药基因的获得，产生了新的致病和耐药特性。细菌基因组多态性产生的遗传机制一般认为主要有以下几种:以特定频率产生点突变、基因组重排、基因获得和缺失、重复序列等。致病菌获得的这些遗传变异使之与环境和宿主的斗争中得以实现“适者生存”，因此掌握其遗传变异规律，就会使得我们在与其斗争中占据主动地位，能够在新的致病性菌株出现之前进行预警，提前做好防控，并根据其变异规律制订有效的防治研究策略。基因组学研究的进展为细菌微进化研究奠定了良好基础。截至到2014年3月，国际上已经完成了23038株细菌基因组序列的测定，几乎涵盖了所有致病菌物种。大量基因组测序工作的完成，为比较基因组和基因组多态性研究提供了可能。在此基础上，针对一些重要的致病性细菌建立基因组多态性数据库，对其进化研究、微生物法医学溯源和分子流行病学分析有着重要作用。
　　本研究的目的在于:①收集并整合重要致病菌基因组多态性数据，建立数据库，为传染病防控和致病菌的微进化研究提供数据支撑;②编制在线分析平台，用于致病性细菌的分型和系统发育分析研究，以及疾病爆发时病原体的来源追踪。重要致病性细菌基因组多态性数据的收集与整合
　　针对鼠疫耶尔森氏菌、布鲁氏菌、大肠杆菌O157∶H7、结核分枝杆菌、志贺氏菌、副溶血弧菌和沙门氏菌等八种重要致病性细菌物种，我们分别通过文献检索、网络数据库挖掘和与合作实验室数据共享等方式，收集其MLST(multilocussequence typing，多位点序列分型)、MLVA(multiple-locus VNTR analysis，多位点VNTR分析)、SNP（single nucleotide polymorphism，单核苷酸多态性）、DFR（different region，差异区段）、CRISPRs(clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，规律成簇的间隔短回文重复)及IS（insertion sequence，插入序列）共六类基因组多态性数据。
　　重要致病性细菌基因组多态性数据库的构建及应用
　　通过对重要致病性细菌基因组多态性数据的收集与整合，我们将相关数据分成三类:1）菌株背景信息，包括分离时间、分离地点、生化表型等;2）基因组多态性数据，包括各物种六类多态性位点(MLVA，SNP，DFR，MLST，CRISPR，IS)的基因组位置、上下游序列，以及在总计11123株分离株中的状态等;3）全基因组序列及注释信息，包含完成全基因组测序菌株的DNA序列和以基因为单位的注释信息。为了使各部分数据规范化、模块化，我们编写了若干Perl脚本对其进行解析。之后按照关系性数据库的构建步骤，设计了数据库的ER（entity-relationship，实体关系）模型，选择免费开源的DBMS(databasemanagement system，数据库管理系统)MySQL作为后台的管理系统并将这些数据实施入库。
　　为了满足对重要致病菌基因组多态性深入分析的需要，结合疾病防控、快速溯源和反生物恐怖工作的需求，在已构建的基因组多态性数据库的基础上，我们开发了基于web的分析平台。平台包含四个模块:1）检索模块:在客户端为普通用户提供数据库的检索。用户可以通过设定的关键词搜索，也可以通过字段索引来浏览;2）分型模块:用户通过分子生物学实验获得病原菌分离株的某类基因组多态性数据后，可使用分型模块提供的多态性数据比对功能，获得待比对菌株的基因分型结果;3）溯源模块:利用数据库中已有的基因组多态性数据，以及计算相似性指数和构建系统发育关系等方法，用户可以对引起疾病爆发的菌株进行来源追踪。4）序列比对模块:用户可将新获得的菌株基因组序列与数据库中对应的致病菌参考序列(reference sequence)进行相似性比对，快速获得新菌株基因组的多样性信息。
　　结论与意义
　　本研究以鼠疫菌为模型，设计构建了囊括八种重要致病性细菌基因组多态性信息的数据库和在线数据分析平台。数据库囊括了我国常见的8种重要致病性细菌，共收录11123株致病菌菌株的背景信息、6类基因组多态性数据、上万个基因组多态性位点。遭遇传染病流行或生物恐怖袭击时，用户登录基因组多态性数据库，以数据检索的方式获得已发表或者第三方数据库已收录的多态性数据，然后通过web平台提供的数据比对和系统发育分析功能，即可实现基于现有数据的自动分型和来源追踪。该平台已经成功应用于2009年青海原发性肺鼠疫爆发的疫情调查，为判断菌株的来源提供了可靠的证据。

目录

声明

缩略语表

摘要

前言

第一章 重要致病性细菌基因组多态性数据的收集与整合

1 细菌基因组多态性

1．1 多位点序列

1．2 多位点VNTR

1．3 规律成簇的间隔短回文重复

1．4 单核苷酸多态性

1．5 差异区段

1．6 插入序列

2 基因组多态性数据的收集与整合

2．1 鼠疫耶尔森氏菌

2．2 布鲁氏菌

2．3 结核分枝杆菌

2．4 幽门螺杆菌

2．5 大肠杆菌O157：H7

2．6 志贺氏菌

2．7 沙门氏菌

2．8 副溶血弧菌

第二章 重要致病性细菌基因组多态性数据库的构建

1 关系型数据库的构建

1．1 鼠疫菌基因组多态性关系数据库的构建

1．2 重要致病性细菌基因组多态性关系数据库的构建

2 基于web的应用程序设计

2．1 开发工具

2．2 检索模块

2．3 分型模块

2．4 溯源模块

2．5 序列比对模块

第三章 重要致病性细菌基因组多态性数据库的应用

1 基本应用

1．1 检索

1．2 分型

1．3 溯源

1．4 序列比对

2 应用实例

3 结果与讨论

综述 微生物法医学溯源与细菌基因组多态性数据库

参考文献

附录

代表性论文

个人简历

致谢