用于狂犬病口服免疫的犬2型腺病毒重组载体的相关技术研究

摘要

狂犬病(Rabies)是由弹状病毒科(Rahbdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus)中的狂犬病病毒（Rabies Virus，RABV）引起的一种以脑脊髓炎为主要特征的人兽共患传染病。狂犬病危害严重，发病后死亡率几乎为100％，目前尚无有效治疗手段。本病在世界范围内均有流行，全球每年有约55000人死于狂犬病，大部分病例发生在人口密度较高、经济不发达的亚洲和非洲等发展中国家或地区。我国目前每年仍有狂犬病死亡病例约2000人，曾一度位列法定报告传染病首位。
　　动物是狂犬病最主要的传播宿主。在北美、西欧等发达国家，狂犬病的主要宿主为浣熊、狐狸、臭鼬、蝙蝠等野生动物，在发展中国家，狂犬病主要在犬群中传播和流行，发生外溢时，可能导致人或其他家畜感染。而在我国，非免疫的农村家养犬和流浪犬、猫的大量存在是狂犬病得以不断传播并导致人发生狂犬病的根本原因，同时，鼬獾等野生动物也是狂犬病传播的重要宿主。
　　控制动物狂犬病是防止狂犬病向人和其他家畜传播的重要措施，免疫预防则是控制动物狂犬病的最有效手段。目前用于家养动物狂犬病免疫的主要是灭活疫苗，部分国家同时采用弱毒活疫苗。上述两类疫苗只能通过注射免疫，对流浪犬、猫及野生动物无法实施。因此，早在上个世纪60年代就有学者提出对这些动物进行口服免疫，并且在北美、西欧地区采用狂犬病病毒ERA株、SAG1株等弱毒疫苗、表达狂犬病病毒糖蛋白的重组痘苗病毒及重组人5型腺病毒进行大规模野外投放，有效遏制了狂犬病在野生动物中的传播和流行，甚至在部分地区消除了狂犬病。但基于狂犬病弱毒株的口服疫苗，在使用中不断发现其可导致零星狂犬病的发生，某些重组疫苗可引起暴露者发生载体病毒的感染，存在安全隐患;与此同时，这些适用于野生动物的疫苗对犬的免疫效果不佳，因而迄今未能在流浪犬群中使用。研制更加安全、且适合犬尤其是流浪犬的口服狂犬病疫苗，对诸如我国和印度等国家的狂犬病防控具有重要的现实意义。
　　犬腺病毒(Canine Adenovirus，CAV)是腺病毒科的典型成员之一，分为两型:犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1)及犬2型腺病毒(CAV-2)，前者为犬传染性肝炎病毒，后者为犬传染性喉气管炎病毒，二者具有完全的交叉保护作用，目前临床上常采用CAV-2的弱毒株作为疫苗，用于预防这两种病毒的感染。同时， CAV-2具有可通过口腔感染的特性，其基因组的E3区为复制非必需区，部分或完全缺失后，不影响其增殖，可作为载体用于重组口服疫苗的构建及目的抗原的表达。本实验室先后构建了基于CAV-2的狂犬病重组疫苗，为尽早将其应用于实际，本研究对本病毒口服免疫的相关技术和应用的可行性做了进一步的探讨。
　　基于以上，本研究开展了以下试验:
　　1.重组犬2型腺病毒口服食饵的研制。试验内容:①口服疫苗食饵的制备:将106.875 TCID50/100μL的表达绿色荧光蛋白的重组犬2型腺病毒（CAV-2-EGFP）培养液与面粉、秘鲁鱼粉按照2∶2∶1的质量比混合均匀，制成口服疫苗食饵，分成重量40g、直径4cm大小的球状，置入定制的网袋中;②口服食饵内载体病毒的存活稳定性试验:于不同环境（-20℃、室温避光、室外）和不同时间(0、3、7、28天)后，用DMEM培养液等质量稀释食饵，经10倍连续稀释后，接种细胞，测定感染性病毒量;③载体病毒的免疫试验:通过犬免疫试验，利用病毒中和抗体检测方法进行犬腺病毒中和抗体的测定。
　　2.犬群中犬腺病毒中和抗体的调查。试验内容:①CAV-2-EGFP TCID50的滴定;②取自河北省、北京市、吉林省等城乡犬只血清中犬腺病毒中和抗体的检测和分析。
　　3.狂犬病病毒BD06株糖蛋白-重组犬2型腺病毒基因组的构建。试验内容:①BD06株糖蛋白表达盒的构建;②E3区缺失性中间载体pVAX-△E3-CGS的构建;③重组犬2型腺病毒-狂犬病病毒糖蛋白重组基因组pPolyⅡ-CAV-2-CGS的获得及鉴定。
　　通过以上试验，取得以下结果:
　　1.制成食饵后即刻测定的病毒含量为105.875 TCID50/100μL;-20℃贮存3、7、28天后，病毒量分别为105.875 TCID50/100μL、105.875 TCID50/100μL、105.625TCID50/100μL;室温避光下3、7、28天后，病毒量分别为105.625 TCID50/100μL、105.375 TCID50/100μL、103.5 TCID50/100μL;室外条件下3、7、28天后，病毒量分别为105 TCID50/100μL、104.125 TCID50/100μL、102.125 TCID50/100μL。免疫试验显示犬体内抗CAV抗体低于1∶27时，经一次口服免疫病毒量为105.875TCID50/100μL的口服疫苗后，抗CAV中和抗体均升高，抗体水平≥1∶243;犬免疫前抗CAV抗体过高(≥1∶2187)时，免疫后抗体水平则下降。
　　2.犬腺病毒中和抗体调查显示，387份样品中，河北省农村犬血清147份，其中CAV中和抗体阳性样本27份，阳性率为18％;北京市各区宠物医院犬血清195份，其中CAV中和抗体阳性样本135份，阳性率为69％;吉林省农村犬血清45份，其中CAV中和抗体阳性样本3份，阳性率为7％，以上结果显示，农村犬只犬腺病毒感染率总体不超过20％，明显低于城市犬。
　　3.利用AscⅠ、ClaⅠ、NruⅠ、SacⅠ限制性内切酶酶切鉴定重组基因组pPolyⅡ-CAV-2-CGS，目的条带与理论计算值相同;所设计的两对引物分别能够扩增出1433bp和2227bp两个片段，经测序表明糖蛋白完整的表达盒已经插入到缺失1041bp的E3区内，即获得重组质粒pPolyⅡ-CAV-2-CGS。
　　根据以上结果，得到下列结论:
　　1.制备了适合于投放和犬摄食的食饵，重组犬2型腺病毒在放置于室外环境的食饵中7天内具有较好的稳定性，并确定犬腺病毒中和抗体低于1∶27时，经单次免疫其中和抗体水平得到显著提高，为该载体重组疫苗的应用提供了关键数据。
　　2.河北省、吉林省农村地区的犬群中犬腺病毒中和抗体平均阳性率为16％，明显低于北京城区犬只中的犬腺病毒中和抗体水平。说明农村地区犬腺病毒自然感染率或接种率较低，以犬2型腺病毒为载体的狂犬病重组疫苗适合于农村地区犬群的使用。
　　3.构建完成了携带具有良好免疫原性的狂犬病病毒BD06株糖蛋白的重组犬2型腺病毒基因组。
　　论文创新点:
　　1.首次在国内探索了适合于犬食用的疫苗食饵，并明确了重组犬2型腺病毒载体在食饵中的稳定性。
　　2.通过中和试验阐明了我国犬群中犬腺病毒中和抗体比例，确定了重组犬2型腺病毒疫苗载体在农村地区犬群中使用的可行性。

目录

声明

英文缩写词表

摘要

前言

第一篇 研究内容

第一章 重组犬2型腺病毒载体口服食饵研制

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二章 我国部分地区犬群犬腺病毒中和抗体调查

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第三章 狂犬病病毒BD06株糖蛋白-重组犬2型腺病毒基因组的构建

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

参考文献

第二篇 文献综述

发表论著

个人简历

致谢