南极适冷菌Pseudomonas sp.C抑菌活性物质的分离纯化与相关功能基因的初步研究

摘要

极地是一个微生物资源宝库,其微生物具有种质的新颖性和多样性,由于极地特殊的环境,有可能从极地微生物中发现结构新颖的生物活性物质。对活性物质生物合成的有关功能基因进行研究,可以预测产生化合物的类型,降低同样结构化合物重复出现的概率。
　　以常见植物病原真菌尖刀镰孢菌为指示菌,对中国第27次南极科学考察采取的海水以及第4次北极科考采取的沉积物(BN05)进行了抗植物病原真菌活性菌株的筛选,并对其进行了分子鉴定与系统发育分析。结果表明,共筛选到25株抗植物病原真菌的活性菌株,其中2株属于嗜冷杆菌属(Psychrobacter),4株属于假单胞菌属(Pseudomonas),19株属于假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)。抑菌谱研究表明,菌株312-1、83-1和195对大丽轮枝菌、瓜亡革菌、番茄早疫病菌、水稻纹枯病菌、芦笋茎枯病菌、辣椒疫霉和尖刀镰孢菌均具有明显的抑菌效果;除水稻纹枯病菌外,312-2对其他6种植物病原真菌也均有明显的抑菌活性。对实验室保藏的活性菌株的活性验证试验表明,南极适冷菌C、LX-4、LX-2和1-Z18活性较好。选取活性较好且稳定的南极适冷菌Pseudomonas sp.C作为进一步研究的对象。
　　南极适冷菌Pseudomonas sp.C发酵液上清活性物质性质的初步研究表明,在温度40-70℃和pH5-9范围内,发酵液上清的抑菌活性稳定。根据活性追踪,通过硅胶柱层析和高效液相色谱对南极适冷菌Pseudomonas sp.C发酵液上清中的生物活性物质进行了分离纯化、利用EI-MS/MS和核磁共振技术(13CNMR和1HNMR)对分离纯化得到的化合物进行了结构鉴定。本文共分离得到并确定了10个化合物的结构,分别为环二肽类、二肽、壬基酚聚氧乙烯醚类、乙酰肼的衍生物、酯类化合物、甾体类和吲哚二酮类衍生物。其中环(Phe-Pro)、14-壬基苯氧基-3,6,9,12-四氧十四烷-1-醇(壬基酚聚氧乙烯醚类)对尖刀镰孢菌与枯草芽孢杆菌的抑菌活性较强;9,19-Cyclocholestan-3-one,4,14-dimethyl-(甾体类)对尖刀镰孢菌具有一定的抑菌活性。
　　利用活性物质不同生物合成途径的三对简并引物(PKS-U/PKS-D、NRPS-U/NRPS-D和HALO-U/HALO-D)对筛选到的抗植物病原真菌活性菌株进行了功能基因的扩增。结果表明,从菌株C和1-Z18扩增到了PKS基因片段,从6株活性菌株(C、1-Z18、LX-2、LX-4、195和83-1)中均扩增到了NRPS基因片段,从菌株1-Z18扩增到了卤代酶基因片段。从菌株1-Z18中均扩增到了PKS、NPRS和卤代酶基因片段,表明该菌株可能产生结构新颖的代谢产物,有待进一步研究。利用基因步移技术,扩增了Pseudomonas sp.C的NRPS基因片段的两侧未知序列。

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第1章 绪论

1.1 海洋与极地微生物生物活性物质

1.2 生物活性物质生物合成相关功能基因的研究

1.3 极地微生物研究应用的展望

1.4 论文的研究意义及主要研究内容

第2章 极地微生物抗植物病原真菌活性菌株的筛选及系统发育分析

2.1 材料与方法

2.2 极地抗植物病原真菌活性菌株的筛选

2.3 结果与分析

2.3 讨论

2.4 小结

第3章 南极适冷菌Pseudomonas sp. C抑菌活性物质的分离纯化与结构鉴定

3.1材料与方法

3.2 结果与分析

3.3 讨论

3.4 小结

第4章 活性菌株次生代谢产物合成相关基因PKS、NRPS及卤代酶基因的克隆与分析

4.1 材料与方法

4.2 PKS、NRPS及卤代酶基因的克隆

4.3 结果与分析

4.4讨论

4.5小结

第5章 总结与展望

5.1 总结

5.2 研究的展望

参考文献

附录

致谢

在学期间主要科研成果