芥子气脂肪蓄积新发现的生物学效应研究

摘要

芥子气(Sulfur Mustard，SM)是一种具有强烷基化能力的起疱剂，可快速透过皮肤、眼睛和肺支气管粘膜等途径进入生物体内与多种生命物质发生反应。由于其制备简单、杀伤力大，在战争中被广泛使用。当前，日本二战后遗弃在华的大量化学武器，其中以SM为主，仍在威胁中国人民的生命和财产安全。随着近年来国际极端民族主义和宗教主义的死灰复燃，SM被用于恐怖袭击和不对称战争的可能性日益增大，因此继续对SM损伤机理和防治手段的研究仍有重要的现实意义。
　　自首次合成至今，对SM的毒理机制研究已持续了一个多世纪，科学家对SM损伤机制提出了很多假说，但其明确机理仍然未知。由于芥子气具有亲脂性，暴露后会迅速透过机体表面屏障，侵入机体组织和循环系统，可与DNA、蛋白质等绝大多数生物分子发生广泛烷基化反应。这些分子的烷基化会影响DNA的合成与修复，干扰酶活和细胞代谢，最终导致细胞凋亡、机体炎症、免疫反应和代谢紊乱的发生。同时SM损伤存在潜伏期，其症状在暴露数小时后才会出现，且症状反复多样，目前尚无SM损伤的特效治疗方案。因此SM仍是一种难防难治的化学战剂。
　　本课题组前期研究建立的SM原型的衍生化液-质联用检测方法，针对SM原型在大鼠组织中的分布进行研究，结果提示脂肪组织中SM原型存在高水平持续留存，发现了SM脂肪蓄积的新现象并进行了验证。同时通过SM-DNA加合物同时定量检测方法的建立，本课题组对SM-DNA加合物在大鼠组织中的分布进行了研究，发现脂肪含量高的组织中，如骨髓和脑，其SM-DNA加合物含量也较高，且SM-DNA加合物在脂肪组织中可较长时间持续存在，提示亲脂环境对加合物形成可能具有显著影响。
　　基于实验室前期的研究结果，本论文通过体外染毒后脂肪细胞在DNA加合物形成、存活率和细胞损伤评价，以及大鼠染毒后脂肪组织脂体系数、病理损伤评价，对SM脂肪蓄积的毒性效应进行了研究;通过染毒后大鼠脂源因子mRNA水平和蛋白水平评价，初步探讨了SM脂肪蓄积的生物学意义。全文共分为五章。
　　第一章是前言。该部分对SM在理化性质、历史、损伤机制方面的研究进展进行了介绍，并对近年来脂肪组织功能和脂源因子研究的成果进行了评述。提出了本论文的研究目的、研究内容和创新点。
　　第二章是体外染毒模型的建立。通过分离大鼠原代前脂肪细胞，对脂肪细胞分化条件进行了优化;通过培养人皮下前脂肪细胞（Human Preadipocytessubcultaneous，HPA-s），成功获得高分化率(80％)的成熟脂肪细胞(HumanAdipocytes subcultaneous，HA-s);并成功培养传代三种SM主要损伤组织的人源化细胞包括人永生化角质形成细胞(HaCaT)、人肺纤维细胞(HLF)、正常人类肝细胞(L-02)，作为对照细胞，为SM脂肪蓄积研究体外染毒实验提供细胞模型。同时通过CCK-8方法检测包括成熟脂肪细胞在内五种细胞的SM染毒IC50，结果显示HA-s细胞的SM染毒IC50(484.3±22.7μM)远高于其它四种细胞(HaCaT77.5±5.5μM、HLF69.9±4.3μM、L-0273.8±3.7μM、HPA-s62.5±0.4μM)，初步说明脂肪细胞对SM染毒具有抵抗能力。
　　第三章是体外染毒SM-DNA加合物检测。基于已建立的UPLC-MS/MS方法，进行了方法学验证。结果表明该方法对从体外染毒细胞中提取SM-DNA加合物的检测，具有较好的选择性、检测线性、准确度、精密度和稳定性，其定量限低(N7-HETEG为0.02 ng/mL、Bis-G为0.05 ng/mL、N3-HETEA为0.1 ng/mL)，基质效应小，回收率高，样品稳定性也较好。各项参数均符合验证要求。确定其可被用于体外染毒细胞SM-DNA加合物的同时定量检测。通过对包括成熟脂肪细胞在内的五种细胞进行体外染毒SM-DNA加合物的量时关系进行检测，对包括成熟脂肪细胞在内的不同染毒细胞SM-DNA加合物形成差异进行了研究。结果表明SM-DNA单取代加合物形成速度高于双取代加合物，而三种加合物的相对含量依次为:N7-HETEG＞Bis-G＞N3-HETEA;不同细胞SM-DNA加合物形成的峰值差异较小，但成熟脂肪细胞双取代加合物占比更高(＞33％)，在SM-DNA加合物达峰时间和清除速度上也低于其它组织来源细胞。从而在体外水平证实了SM脂肪蓄积现象和脂肪细胞对SM染毒的抵抗能力。
　　第四章是SM体外染毒对细胞功能的影响。通过高内涵分析，从细胞核和细胞形态、溶酶体、线粒体、氧化应激和DNA损伤方面对HPA-s和HA-s在SM染毒后细胞损伤与染毒剂量和染毒时间的变化趋势进行研究。结果显示SM染毒造成了细胞损伤，其程度与染毒剂量和染毒时间成依赖关系;染毒HA-s在溶酶体、线粒体、氧化应激和DNA损伤方面细胞毒性指标随染毒剂量和时间变化的速度和水平均低于HPA-s。从细胞毒性参数角度揭示了成熟脂肪细胞对SM染毒损伤抵抗能力。同时选择HA-s和HLF染毒上清与HaCaT、HLF和L-02染毒细胞共培养，通过CCK-8方法对染毒上清共培养细胞的活性进行检测，研究HA-s和HLF染毒上清对其它细胞活性的影响。结果表明HLF细胞染毒上清会提高其它细胞体外染毒IC50值;而HA-s细胞染毒上清则会降低其它细胞体外染毒IC50值，同时降低程度与HA-s的染毒剂量成依赖关系。提示了脂源因子对其它细胞的生长抑制作用及脂肪蓄积SM的继发毒性，以及清除脂肪细胞中的SM对降低机体继发损伤的重要性。
　　第五章是SM染毒对大鼠脂肪组织功能的影响。通过大鼠染毒模型，获得染毒大鼠体重和脂体系数变化趋势数据。结果显示脂肪组织在机体染毒应激反应过程中被剧烈消耗，提示了脂肪中蓄积的SM随组织剧烈消耗而再次释放的可能。
　　通过病理切片，评价了皮下、肾周、附睾和褐色脂肪组织的病理损伤情况。结果显示脂肪组织暴露损伤主要体现为血管扩张，和血管周围炎症细胞浸润，对成熟脂肪细胞的损伤则并不明显。从体内水平验证了成熟脂肪细胞对SM染毒的抵抗能力。
　　通过RT-qPCR和定量ELISA，对大鼠皮下脂肪组织中各脂源因子水平进行检测。结果显示SM染毒会导致促炎因子上调、抑炎因子下调，脂肪细胞分化因子和能量代谢因子的分泌也受到影响。而脂源因子在皮下脂肪和血清中的含量变化趋势相同。一方面证明暴露后脂肪组织局部炎症和机体系统炎症的同步发生和发展;另一方面说明脂肪组织在SM暴露后不但具有重要的能量供应作用，更可发挥重要炎症和代谢调节作用，揭示了SM脂肪蓄积的重要生物学意义。

目录

声明

缩略词表

摘要

1 前言

1．1 芥子气(SM)

1．1．1 理化性质

1．1．2 难防难治的SM

1．1．3 SM的研究历史及新时期特点

1．2 SM损伤机理

1．2．1 SM与DNA损伤

1．2．2 SM-DNA加合物的检测

1．3 SM脂肪蓄积现象

1．3．1 脂肪组织功能

1．3．2 脂源因子

1．4 本论文研究目的、内容和创新点

1．4．1 研究目的及意义

1．4．2 研究内容

1．4．3 创新点

2 体外染毒模型建立

2．1 引言

2．2 材料及仪器

2．2．1 实验仪器

2．2．2 试剂材料

2．2．3 溶液配制

2．3 实验方法

2．3．1 细胞培养

2．3．2 细胞生长曲线测定

2．3．3 前脂肪细胞分化条件优化及鉴定

2．3．4 SM体外染毒IC50检测

2．4 结果与讨论

2．4．1 细胞生长曲线

2．4．2 前脂肪细胞分化条件优化及鉴定

2．4．3 SM染毒IC50检测

2．5 小结

3 体外染毒SM-DNA加合物检测

3．1 引言

3．2 材料与仪器

3．2．1 实验仪器

3．2．2 试剂材料

3．2．3 溶液配制

3．3 实验方法

3．3．1 样品前处理

3．3．2 SM-DNA加合物UPLC-MS／MS检测方法

3．3．3 体外染毒SM-DNA加合物UPLC-MS／MS检测方法学验证

3．3．4 SM染毒实验注意事项

3．3．5 体外染毒SM-DNA加合物与细胞浓度间的量效关系

3．3．6 体外染毒SM-DNA加合物与SM染毒剂量间的量效关系

3．3．7 体外染毒SM-DNA加合物与染毒剂中FBS含量间的量时关系

3．3．8 不同细胞体外染毒DNA加合物的量时关系

3．4 结果与讨论

3．4．1 UPLC-MS／MS方法学验证

3．4．2 体外染毒SM-DNA加合物与细胞浓度间的量效关系

3．4．3 体外染毒SM-DNA加合物与染毒剂量间的量效关系

3．4．4 体外染毒SM-DNA加合物与染毒剂中FBS含量间的量效关系

3．4．5 不同细胞体外染毒DNA加合物的量时关系

3．5 小结

4 SM体外染毒对细胞功能的影响

4．1 引言

4．2 材料与仪器

4．2．1 实验仪器

4．2．2 试剂材料

4．2．3 溶液配制

4．3 实验方法

4．3．1 SM染毒实验注意事项

4．3．2 成熟脂肪细胞体外染毒HCS分析

4．3．3 不同细胞染毒上清共培养对细胞染毒IC50的影响

4．4 结果与讨论

4．4．1 体外染毒细胞毒性多参数分析

4．4．2 不同细胞染毒上清共培养对细胞染毒IC50的影响

4．5 小结

5 SM染毒对大鼠脂肪组织功能的影响

5．1 引言

5．2 材料与仪器

5．2．1 实验仪器

5．2．2 试剂材料

5．2．3 溶液配制

5．3 实验方法

5．3．1 SM染毒实验注意事项

5．3．2 大鼠皮肤染毒模型建立

5．3．3 大鼠脂肪组织病理切片制备

5．3．4 大鼠脂肪组织脂源因子mRNA水平检测

5．3．5 大鼠脂肪组织和血清中脂源因子蛋白水平检测

5．4 结果与讨论

5．4．1 大鼠脂体系数

5．4．2 大鼠脂肪组织病理损伤

5．4．3 大鼠脂肪组织脂源因子mRNA水平检测

5．4．4 大鼠脂肪组织和血清中脂源因子蛋白水平检测

5．5 小结

结论

参考文献

文献综述 芥子气生物标志物及防治药物的筛选评价

发表学术论文

个人简历

致谢