防治地黄连作障碍有益细菌生物学特性及大田定殖能力的研究

摘要

地黄（Rehmannia glutinosa Libosch）连作障碍是阻碍地黄产量增加的主要原因之一，寻找克服地黄连作障碍的方法是目前中药学研究的热点课题之一。研究认为地黄连作导致根际微生物区系失衡是连作障碍发生的主要原因之一。本研究对克服地黄连作障碍的有益菌株活性及大田定殖能力进行研究，主要目的是利用有益菌株克服地黄连作障碍。
　　利用菌落形态、菌体形态、生理生化试验对实验室前期研究得到的对克服地黄连作障碍的有益菌株：1~10号菌进行传统方法的鉴定；并利用分子生物学手段，将菌株16SrDNA序列经过NCBI数据库中的Blast比对后，结合传统鉴定结果，最终鉴定1~10号菌株分别为：1、6、9号菌为恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida），2号菌为短黄杆菌（Myroides odoratimimus），3号菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）4号菌为不动杆菌属（Acinetobacter sp.）5号为嗜冷杆菌（Psychrobacter alimentarius），7、10号菌为球形节杆菌（Arthrobacter aurescens.），8号菌为普通变形菌（Proteus vulgaris）。
　　为了方便菌种的保藏及满足菌种开发的要求，对各菌株生长的最适培养基、pH值、温度、摇床转速及保藏条件进行了研究，研究结果表明：适合在 LB培养基中生长的为2、3、5、7、9、10号菌；适合在NB培养基中生长的为1、4、6、8号菌；适合在pH值为7的条件下生长的为1、3、4、10号菌；适合在pH值为8的条件下生长的为2、5、6、7、8、9号菌；适合在28℃条件下生长的为1、2、3、6、8、9、10号菌；适合在30℃条件下生长的为4、7号菌；适合在25℃条件下生长的为5号菌；适合斜面传代保藏的菌种为1、3、6号菌；适合斜面保藏的菌株为2、7、9、10号菌；适合液体甘油法保藏的菌株为1、3、4、5、6、7、8、9、10号菌；适合穿刺保藏的菌株为2号菌；适合砂土管保藏的菌株为2、4、5、8号菌；适合超低温冷冻保藏的菌株为1、3、4、5、6、7、8、9、10号菌。
　　MS培养基中添加生地提取液可以使地黄苗死亡，用1~10号菌分别对组培苗进行浸根处理后，地黄苗都能够成活，但是各菌株作用效果有差异，比较各菌处理的地黄组培苗生长速度及植株长势，其中9号菌作用效果最明显，因此选择9号菌作为施入大田的有益菌株，根据其假单胞菌的特性，利用三亲本杂交法对其进行 Lux发光酶基因标记，标记成功的菌株命名为 C-9号菌，比较标记前后菌株的生理生化等性质及标记前后菌株对地黄组培苗的作用效果，差异不显著(P>0.05)。
　　将C-9号菌施入无菌栽培的地黄盆栽苗根部，每隔5天取样观察C-9号菌在盆栽中的定殖，发现其在盆栽中连续存在95天左右；将C-9号菌培养液施入大田后，每隔5天取样观察，发现其在大田条件下能够存在55天左右，且施入大田后，前期土壤中细菌、真菌数量都显著增多(P<0.05)，放线菌数量显著减少了；后期随着土壤中C-9号菌数量的减少(P<0.05)，细菌、真菌数量有所下降，放线菌数量有所上升，C-9号菌数量越少，各种微生物数量越趋近于施菌前的数量，说明C-9号菌施入土壤后对土壤微生物区系产生了显著影响(P<0.05)。

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第一章 前 言

1.1连作障碍及其机理研究进展

1.2地黄连作障碍的防治

1.3 有益细菌研究中存在的问题及研究方向

1.4细菌的发光特性及发光基因标记

1.5 本研究的背景和目的意义

1.6 研究思路

第二章 地黄连作障碍有益菌株的系统鉴定

2.1 实验材料

2.2 实验方法

2.3 结果与分析

2.4 讨论与小结

第三章 地黄连作障碍有益菌最适生长及保存条件的摸索

3.1供试材料

3.2.试验方法

3.3实验结果与分析

3.4讨论与小结

第四章 克服地黄连作障碍作用最明显有益菌株筛选和标记

4.1实验材料

4.2 试验方法

4.3 结果与分析

4.4讨论与小结

第五章 C-9号菌定殖能力及对土壤微生物种群结构的影响研究

5.1 试验材料

5.2 试验方法

5.3 实验结果与分析

5.4讨论与小结

结论

展望

本研究的创新点

参考文献

致谢

在学期间公开发表论文及著作情况

在学期间参加的学术会议