耐药质粒RP4在不同微生物聚集体中水平转移规律及其对氨氧化的影响

摘要

细菌耐药性扩散以及耐药基因的广泛传播严重威胁着人类健康。耐药基因作为一类新型环境污染物，越来越引起研究者的广泛关注。世界卫生组织报告称抗生素耐药基因将会是本世纪威胁人类健康最重大的挑战之一，甚至有报道预计2050年每年因耐药菌感染死亡的人数将比现在癌症患者还要多。污水生物处理系统作为水循环的重要环节，其不仅是抗生素药物进入环境的一个重要途径，同时也是耐药细菌、耐药基因富集，并在环境中播散的一个重要污染源，生物处理系统中耐药基因水平转移问题直接关系到环境生态安全。
　　污水生物处理系统过程复杂，由于工艺运行方式和反应器的构造不同，可以形成不同形态的微生物聚集体。课题构建好氧颗粒污泥生物反应系统(Granular Sludge Bioreactor,GSBR)，以系统中不同形态微生物聚集体为研究对象，将粒径(D)小于0.18mm定义为絮状污泥，颗粒污泥分为三个粒径范围：小粒径颗粒污泥(0.18mm＜D＜0.45mm)，中等粒径颗粒污泥(0.45mm＜D＜0.9mm)与大粒径颗粒污泥(D>0.9mm)。采用携带具有广泛宿主RP4质粒的E.coli K12(RP4)为供体菌，进行一次性高浓度E.coli K12(RP4)投加，利用实时荧光定量PCR技术追踪RP4质粒在不同形态微生物聚集体中的分布变化，探讨耐药基因在不同微生物聚集体中水平转移规律。结果显示，第8d投加供体菌E.coli K12(RP4)后，GSBR中各粒径污泥比例出现波动，第18d后重新达到动态平衡。其中大粒径颗粒污泥占总污泥比例70％以上，是GSBR中主要微生物聚集体形态。投加供体菌后，因E.coli K12(RP4)被淘洗出GSBR，RP4质粒不断减少。RP4质粒的丰度随污泥粒径增大而降低，其中丰度最高的为絮状污泥，投加供体菌后絮状污泥中RP4质粒丰度达到8.10×10-2，4d后降低至4.14×10-6。丰度最低的为大粒径颗粒污泥，投加供体菌后大粒径颗粒污泥中RP4质粒丰度为1.43×10-3，4d后降低至1.42×10-8。RP4质粒在大粒径、中等粒径、小粒径颗粒污泥中存留时间分别为7d，14d和13d。第13d后RP4质粒在絮状污泥中的丰度稳定维持在1.2×10-6-1.6×10-6之间，直至第26d后检测为阴性。由此可得出以下结论：RP4质粒在不同微生物聚集体中的水平转移效率不同，污泥粒径越大，RP4质粒的水平转移效率越低。相比于絮状污泥，好氧颗粒污泥系统能降低耐药基因在污泥中的水平转移，可有效控制耐药基因传播和扩散的生态风险。在无抗生素选择压力下，耐药基因在絮状污泥中存留时间长，依然会对生态系统产生影响，表明耐药基因的传播范围已经超过了抗生素的污染范围。控制耐药基因的扩散，一方面需规范抗生素的使用，另一方面需要有效控制耐药基因的转移和传播。
　　硝化反应在自然界的氮循环中起着重要作用，同时也是污水系统生物脱氮的关键反应，其包含了氨氧化细菌(Ammonia-oxidizing Bacteria, AOB)进行的氨氧化作用和亚硝酸盐氧化细菌(Nitrite-oxidizing Bacteria,NOB)进行的亚硝酸盐氧化作用。AOB是硝化菌群的重要组成部分，氨氧化代谢反应也是生物硝化过程中限速步骤和最为敏感的反应之一。耐药基因作为生物大分子，可直接参与细菌代谢，甚至影响、改变生物代谢过程，进而直接影响污水生物处理系统的污染物去除效率。课题分别以GSBR和以自养硝化菌为主体的硝化污泥生物反应系统(Nitrification Sludge Bioreactor,NSBR)为研究对象，采用供体菌E.coli K12(RP4)不同投加方法，观察GSBR与 NSBR系统中氨氮去除率的变化以及典型周期内氨氮去除效果，利用培养计数法和实时荧光定量PCR技术对供体菌和RP4质粒进行计数和定量追踪，采用变性梯度凝胶电泳技术(PCR-DGGE)对污泥中 AOB菌群结构多样性进行观察，对DGGE图谱中主要优势条带进行切胶测序，将测序结果在GenBank数据库中进行比对和鉴定，采用MEGA软件建立进化树进行AOB菌群同源性分析。同时利用实时荧光定量PCR技术对AOB菌群丰度进行分析，分别针对不同系统中耐药基因水平转移对氨氮去除效率影响，氨氧化菌群变化以及代谢活性影响机制进行研究。研究结果表明，GSBR系统中一次性投加高浓度供体菌E.coli K12(RP4)对COD、氨氮的去除效果均有影响，但对氨氮去除的影响更加明显。第8d投加E.coli K12(RP4)后，氨氮去除效果下降，第9d氨氮去除率最低为32.8%，随后氨氮去除率恢复缓慢，直至第19d恢复至投加供体菌前水平。GSBR中大粒径和中等粒径颗粒污泥优势AOB菌群稳定，絮状污泥和小粒径颗粒污泥优势AOB发生了演变，但优势AOB为亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)以及与其同源性较高的菌群，因此认为GSBR中AOB菌群结构稳定。投加E.coli K12(RP4)后，GSBR中各粒径污泥AOB菌群丰度较为稳定，反应器运行后期絮状污泥和小粒径颗粒污泥AOB出现增长。RP4质粒影响了AOB的代谢活性，随着GSBR中RP4质粒的减少，AOB代谢活性逐渐恢复，新生AOB增长，GSBR氨氧化作用恢复。NSBR系统中，连续投加低浓度与高浓度E.coli K12(RP4)时，供体菌E.coli K12(RP4)并没有因连续投加而在NSBR中定植与生长，并且数量不断减少，RP4质粒在总细菌中仍维持稳定的比例，因此RP4质粒发生了由异养供体菌向自养硝化菌的水平转移。连续投加低浓度 E.coli K12(RP4)时，氨氮降解速率减慢，氨氧化能力受到影响，而亚硝酸盐氧化能力未受其影响。连续投加高浓度E.coli K12(RP4)时，氨氮去除效果持续下降至50%-70%之间，氨氧化能力和亚硝酸盐氧化能力均受到影响，出水中出现氨氮和亚硝态氮的累积，水质变差。NSBR中AOB菌群结构稳定，优势AOB菌群同源性高，大多属于亚硝化单胞菌(Nitrosomonas)。AOB丰度在投加低浓度供体菌后轻微增加，投加高浓度供体菌后维持稳定，不再投加供体菌后AOB丰度升高。因此随着RP4质粒由异养供体菌向自养硝化菌发生水平转移，AOB的代谢活性受到影响与抑制。

目录

声明

英文缩略词表

第一章 前言

1.1 细菌耐药性

1.2 水环境中的耐药基因

1.3 微生物聚集体形态

1.4 氨氧化过程

1.5 课题的提出

1.6 研究内容

第二章 RP4质粒在GSBR不同形态微生物聚集体中的水平转移

2.1 前言

2.2材料与方法

2.3 结果

2.4 讨论

2.5 小结和建议

第三章 耐药质粒RP4对GSBR氨氧化过程的影响

3.1 前言

3.2 材料与方法

3.3 结果

3.4 讨论

3.5 小结和建议

第四章 耐药质粒RP4对NSBR氨氧化过程的影响

4.1 前言

4.2 材料与方法

4.3 结果

4.4 讨论

4.5 小结和建议

第五章 结论与创新点

5.1 结论

5.2 创新点

参考文献

附录

代表性论文（一）

代表性论文（二）

个人简历

致谢