消化道恶性肿瘤患者外周血单个核细胞线粒体功能的初步研究

摘要

背景：恶性肿瘤一直以来是严重危害人类健康的一类疾病，在世界范围内，消化道恶性肿瘤的发病率和死亡率均较高。为了阐明恶性肿瘤的形成机制，更好地防治恶性肿瘤，一百多年来人们提出了多个恶性肿瘤形成假说，其中“免疫监视假说”被广泛接受，尤其是近年来基于该假说的免疫（细胞）治疗技术在恶性肿瘤的治疗领域取得举世瞩目的突破和进展。基于该假说，免疫系统具有识别、杀伤并及时清除体内突变细胞，防止肿瘤发生的功能。当机体免疫功能降低时，肿瘤的发生率明显升高，同时肿瘤进行性浸润生长进一步抑制患者的免疫功能。已有研究发现：恶性肿瘤患者的细胞免疫功能普遍低下，肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群的数量和NK细胞的活性均显著下降；小鼠RAG-2基因的敲除对宿主肿瘤影响佐证了免疫监视系统的存在。由于免疫细胞的功能直接或间接依赖于细胞内ATP的能量供应，而线粒体是细胞的能量工厂，主要通过氧化磷酸化为细胞提供动力。基于此，我们提出了“外周血免疫细胞线粒体功能降低与恶性肿瘤发生有关”的假说。
　　目的：本课题通过对消化道恶性肿瘤患者与健康人外周血单个核细胞线粒体功能的病例对照研究，探讨外周血单个核细胞线粒体功能改变与消化道恶性肿瘤发生之间的关系，以验证我们提出的假说，并为今后深入研究恶性肿瘤的发生、发展机制以及诊断和治疗等提供依据。
　　方法：
　　1.研究对象：消化道恶性肿瘤患者来自天津肿瘤医院，所有入选病例组的患者均为首次确诊为消化道肿瘤（胃癌、肝癌、结直肠癌），所有入组研究对象均未进行过手术切除、放化疗。正常对照组来自在同一时期中国人民解放军第272医院门诊健康体检人员，没有肿瘤史。对照组与病例组研究对象的年龄、性别构成无明显差别。所有研究对象均为汉族。
　　2.外周血单个核细胞分离：采集肘静脉血，EDTA-K2抗凝，于室温1600×g离心10min，上层血浆分装后于-80℃保存待用。采用Ficoll密度梯度离心法获得外周血单个核细胞(PBMCs)，主要包括T、B淋巴细胞，NK细胞和单核细胞。
　　3.机体氧化/抗氧化水平的检测：利用DCFH-DA探针测定外周血单个核细胞ROS含量。Mito SOX线粒体红色荧光探针测定外周血单个核细胞线粒体ROS，分光光度计检测血浆总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活力和丙二醛（MDA）的含量。
　　4.外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数的检测：提取肿瘤患者与健康人外周血单个核细胞总DNA，应用实时定量聚合酶链反应（real-time Quantitative Polymerase Chain Reaction，real-time qPCR）测定入选病例组及对照组研究对象外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数。
　　5.外周血单个核细胞线粒体功能的检测：外周血单个核细胞经罗丹明123（Rhodamine123）染色后，应用流式细胞术分别测定CD3+CD19-T细胞、CD3-CD19+B细胞、CD3-CD56+NK细胞、CD14+单核细胞线粒体膜电位；裂解外周血单个核细胞后，萤火虫荧光素酶法测定三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)含量，结果以nmol/mg蛋白表示。
　　6.统计学分析：对检测结果采用SPSS17.0统计软件进行统计学分析，各组实验数据以均数±标准差(-X±S)表示。对于定性数据，比较各组的分布差别时用卡方检验；对于定量数据，比较各组的差别时用单因素方差分析，用SNK法进行两两比较。各检验方法的显著性水平为双侧P＜0.05。
　　结果：
　　1.研究对象一般资料的分布特征：
　　消化道肿瘤病例组与正常对照组在性别（P=1.00）、年龄（56.68±8.42 vs57.20±6.81岁，P=0.68）、长期居住地(天津)、吸烟（P=0.89）、饮酒（P=0.79）、生活方式等混杂因素上具有很好的匹配性。正常对照组（60人）：男性36例，女性24例，平均年龄：57.20岁。各型消化道肿瘤患者（90人）：肝癌患者男性18例，女性12例，平均年龄：56.23岁；胃癌患者男性18例，女性12例，平均年龄：55.8岁；结直肠癌患者男性18例，女性12例，平均年龄：58岁。
　　2.消化道恶性肿瘤患者氧化/抗氧化指标的变化情况：
　　2.1 肿瘤患者血浆氧化/抗氧化水平：
　　血浆T-AOC、GSH-PX活力、MDA含量在正常对照组分别为4.22±1.21U/ml、346.00±45.34U/ml、3.06±0.59nmol/mL，消化道肿瘤组分别为0.88±0.33U/ml、240.77±44.77U/ml、4.78±1.42nmol/mL，表明消化道肿瘤组血浆T-AOC、GSH-PX活力均显著低于正常对照组（P＜0.01）；血浆MDA含量显著高于正常对照组（P＜0.01）。本实验对不同类型消化道肿瘤患者进一步分析发现血浆T-AOC在胃癌（0.87±0.38U/ml）、肝癌（0.95±0.33U/ml）、结直肠癌患者（0.83±0.27U/ml）均显著低于正常对照组（P＜0.01）。血浆GSH-PX活力在胃癌、肝癌、结直肠癌分别为：223.84±43.23U/ml、243.27±53.08U/ml、255.21±30.75U/ml，均显著低于正常对照组（ P＜0.01）。血浆 MDA含量在胃癌（4.99±1.67nmol/mL）、肝癌（4.65±1.39nmol/mL）、结直肠癌（4.69±1.19nmol/mL）均显著高于正常对照组（P＜0.01）。血浆氧化/抗氧化水平在不同类型肿瘤、不同年龄组、性别间均无统计学差异（P＞0.05）。
　　2.2 消化道肿瘤患者外周血单个核细胞氧化水平：
　　正常对照组外周血单个核细胞ROS与线粒体ROS分别为284.69±58.89、20.91±4.19，而消化道肿瘤组分别为421.69±108.11、46.33±12.01，可见消化道肿瘤组与正常对照组相比，单个核细胞ROS与线粒体ROS均显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。进一步分析发现：单个核细胞ROS在胃癌（422.30±110.8）、肝癌（424.58±97.39）、结肠癌（418.18±118.69）均显著高于正常对照组（P＜0.01）。单个核细胞线粒体ROS在胃癌（43.32±8.31）、肝癌（46.11±12.14）、结肠癌（49.56±14.34）均显著高于正常对照组（P＜0.01）。单个核细胞ROS与线粒体ROS含量在不同类型肿瘤、不同年龄组、性别间均无统计学差异（P＞0.05）。
　　3.消化道肿瘤患者外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数：
　　消化道肿瘤组外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数（1.12±0.56）与正常对照组（4.84±1.90）相比显著降低（P＜0.01）。不同类型消化道肿瘤外周血单个核细胞线粒体DNA拷贝数进一步分析发现：胃癌（0.93±0.64）、肝癌（1.22±0.60）、结直肠癌（1.21±0.39）均显著低于正常对照组（P＜0.01）。单个核细胞线粒体DNA拷贝数在不同类型肿瘤间无统计学差异（P＞0.05），并且肿瘤患者单个核细胞线粒体DNA拷贝数在不同年龄组、性别间均无统计学差异（P＞0.05）。
　　4.消化道肿瘤患者外周血单个核细胞线粒体功能的变化情况：
　　4.1 外周血单个核细胞线粒体膜电位的变化情况：
　　外周血单个核细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞线粒体膜电位正常对照组分别为：2809.96±311.54、1567.15±188.66、3206.51±326.87、2512.41±501.76、3127.20±458.74；消化道肿瘤组分别为：1125.88±313.99、1011.38±185.62、1480.98±352.69、1290.40±340.47、1360.83±436.14，可见消化道肿瘤组不同细胞线粒体膜电位均显著低于正常对照组（P＜0.01）。胃癌组单个核细胞线粒体膜电位（1171.94±478.86）、T细胞线粒体膜电位（1024.18±140.16）、B细胞线粒体膜电位（1545.99±67.85）、NK细胞线粒体膜电位（1358.99±481.15）、单核细胞线粒体膜电位（1381.11±514.54）与正常对照组相比均显著下降（P＜0.01）；肝癌组单个核细胞线粒体膜电位（1053.43±196.71）、T细胞线粒体膜电位（937.30±196.55）、B细胞线粒体膜电位（1476.68±309.56）、NK细胞线粒体膜电位（1226.63±159.94）、单核细胞线粒体膜电位（1308.02±431.87）与正常对照组比较均显著下降（ P＜0.01）；结直肠癌组单个核细胞线粒体膜电位（1152.28±161.92）、T细胞线粒体膜电位（1072.65±194.24）、B细胞线粒体膜电位（1420.28±373.64）、NK细胞线粒体膜电位（1285.57±299.30）、单核细胞线粒体膜电位（1393.36±357.93）与正常对照组相比均显著下降（P＜0.01）。不同类型肿瘤间各细胞线粒体膜电位无统计学差异（P＞0.05），并且肿瘤患者各细胞线粒体膜电位在不同年龄组、性别间均无统计学差异（P＞0.05）。
　　4.2 消化道肿瘤患者外周血单个核细胞ATP含量变化情况
　　外周血单个核细胞ATP含量正常对照组为15.18±5.15，消化道肿瘤组为6.96±2.16 （P＜0.01）。不同类型消化道肿瘤的进一步分析发现胃癌（7.34±2.05）、肝癌（6.49±2.31）、结直肠癌（7.04±2.11）ATP含量均显著低于正常对照组（P＜0.01）。外周血单个核细胞ATP含量在不同肿瘤组间无统计学差异（P＞0.05），并且肿瘤患者外周血单个核细胞ATP含量在不同年龄组、性别间均无统计学差异（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.消化道恶性肿瘤患者存在氧化/抗氧化失衡，表现为：血浆T-AOC与GSH-PX活力显著下降；血浆MDA含量上升；外周血单个核细胞ROS含量与线粒体ROS含量均明显升高。
　　2.消化道恶性肿瘤患者外周血单个核细胞线粒体DNA的拷贝数明显降低。
　　3.消化道恶性肿瘤患者外周血单个核细胞线粒体功能降低，即：线粒体膜电位明显下降，ATP合成明显减少。
　　综上所述，消化道肿瘤患者机体的氧化/抗氧化系统失衡，产生过多的ROS，进而，导致外周血单个核细胞膜电位下降、ATP能量合成减少，并可能最终导致外周血单个核细胞的免疫监视功能降低。本研究首次发现外周血单个核细胞线粒体功能降低可能与消化道恶性肿瘤发生有关，为今后深入研究外周血单个核细胞线粒体功能在消化道恶性肿瘤的发生、发展以及诊断和治疗中的作用提供线索。

目录

声明

缩 略 词 表

前言

1 研究背景

课题研究思路：

第一章 消化道恶性肿瘤与机体抗氧化能力的关系

第一节 引言

第二节 实验材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第五节 小结

第二章 消化道恶性肿瘤与外周血单个核细胞线粒体数量的关系

第一节 引言

第二节 实验材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第五节 小结

第三章 消化道恶性肿瘤与外周血单个核细胞线粒体功能的关系

第一节 引言

第二节 实验材料与方法

第三节 实验结果

第四节 讨论

第五节 小结

全文总结

参考文献

发表论文

个 人 简 历

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