半乳凝集素-3糖识别结构域调控肝癌细胞功能的蛋白质组学研究

摘要

肝癌是一种严重威胁人类健康的常见恶性肿瘤。根据最新的全球癌症统计报告称，2012年全球新增肝癌患者74.8万人，同时死亡69.5万人，新增发病率排名第六，死亡率则排名第三。目前，我国肝癌预防和诊断治疗形势仍然十分严峻。
　　Galectin-3是一个与HCC转移密切相关的蛋白。在健康的肝组织中，肝细胞并不表达Galectin-3，但发生癌变的肝组织中，Galectin-3的表达是明显上调的。在肝癌细胞系中过表达Galectin-3会导致细胞增殖和侵袭能力的增强。细胞内Galectin-3主要发挥类似BCL-2家族蛋白的抗凋亡功能。在细胞外空间中，Galectin-3可以与大量的糖基化蛋白结合。依赖于Galectin-3的N端结构域介导的寡聚作用，这些糖基化受体与Galectin-3在细胞表面形成了稳定的晶格状结构，从而调节细胞的功能。
　　一种 N端结构域缺失的Galectin-3的特殊形式仅包含了 Galectin-3的糖识别结构域(Carbohydrate recognition domain，CRD)，简称Gal3C，仅存在于细胞外。目前的研究发现， Gal3C可能在血管生成方面发挥作用，并具备一定的抑制早期肿瘤生长的作用。目前， Gal3C对HCC生长和转移的调控机制仍然不清楚。
　　本论文针对Gal3C在HCC细胞外的功能以及其发挥功能的机制进行了研究，主要的研究目的是：1.发现Gal3C在HCC细胞系HepG2表面的潜在配体；2.发现Gal3C对表达Galectin-3的HepG2细胞的生长会有何种影响；3.发现Gal3C发挥其调控功能的分子机制。
　　本论文结合原核共表达与光反应交联策略、细胞生物学实验手段以及高通量的生物质谱依赖的定量蛋白质组学研究策略，对 Gal3C在 HepG2细胞外表面的潜在配体、Gal3C对HepG2细胞生长迁移和增殖的影响、Gal3C对HepG2细胞的调控机制展开研究。
　　在本论文的第一部分主要研究了Gal3C在HepG2细胞表面的定位以及在细胞表面结合的潜在配体。结合原核共表达策略和光反应活性代谢标记策略，表达了生物素标记的Gal3C重组蛋白Gal3CB以及生物素化/光反应亮氨酸双重标的Gal3C重组蛋白Gal3CBP，并证明Gal3CBP具备了结合乳糖的能力。将Gal3CBP与HepG2细胞孵育，并用紫外线进行交联，然后用FITC荧光显色，显示Gal3CBP主要结合在细胞表面，在细胞与细胞的连接处有聚集的趋势。随后用链霉亲和素亲和层析纯化了交联的细胞组分，对这些组分进行胰蛋白酶酶解、质谱检测和Proteome Discoverer1.4数据库搜索分析，发现Gal3CBP能结合细胞膜上的糖基化蛋白。这些糖蛋白有的是膜上的受体，例如：表皮生长因子受体（EGFR），转铁蛋白受体（TFR1）、胰岛素样生长因子2受体（MPRI）、六磷酸甘露糖受体(MPRD)和甘露糖受体(MRC2)。另外，溶酶体相关膜糖蛋白（LAMP2），细胞表面黏附分子如整合蛋白（Integrin）家族蛋白、基质细胞驱动受体1（NPTN），活性白细胞黏附分子（ALCAM）、神经细胞黏附分子（L1CAM）等与细胞黏附有关的分子也是Gal3C的结合对象。
　　第一部分的研究结果显示，通过用具有光反应交联活性和生物素标记的Gal3CBP，并利用质谱鉴定，发现了一些之前并未报道的Gal3C的结合组分，它们也是 Galectin-3在HepG2细胞膜表面的潜在配体。
　　本论文第二部分的研究研究了细胞外的Gal3CB对HepG2产生的影响。将Gal3CB添加到HepG2的培养体系中，然后用MTT实验分析其对HepG2生长的影响，用划痕修复实验和 Trans-well实验分析其对 HepG2的生长和增殖的影响。结果显示，细胞外过量的Gal3CB能够抑制HepG2的生长，抑制效果随着抑制剂量和时间的增加而增加，50μg/ml的Gal3CB处理HepG2细胞12小时，能使生长抑制率达到50％。划痕修复结果显示，细胞外过量的Gal3CB能够减弱HepG2的迁移。用10μg/ml的Gal3CB处理HepG2细胞12小时后，HepG2的迁移就受到了明显的抑制。Trans-well实验结果显示，细胞外的Gal3C能够抑制HepG2细胞的侵袭能力，抑制效果随着抑制剂量的增加而增加。
　　第二部分的研究结果显示，如细胞外出现大量的Gal3C，则 HepG2的生长、迁移和侵袭都会受到一定程度的抑制。这说明，Gal3C对HCC的生长和转移发挥负调控作用。
　　本论文第三部分的研究内容研究了50μg/ml的Gal3CB处理HepG2细胞12小时后，细胞蛋白质表达谱的动态变化，并探讨 Gal3CB对 HepG2细胞的调控机制。首先，利用13C(6)-Lysine和13（6）-Arginine对HepG2细胞进行SILAC标记，使轻重标记的细胞的相同肽段之间能够产生6.03 Da的质量差，并以此作为相对定量的基础。然后，分别用Gal3C处理重标细胞或轻标细胞，并将处理前后的细胞等量混合，混合后的蛋白进行胰蛋白酶酶切和LC-MS/MS鉴定，以获得蛋白的表达谱以及定量信息。利用在线数据分析软件DAVID Bioinformatics Resources6.8对鉴定到的蛋白进行基因分类和信号通路分析，用IBM SPSS Statistics19对蛋白的定量信息和分布进行统计学分析，用在线的蛋白质相互作用数据处理软件String10对上下调的数据进行蛋白质间的相互作用预测，以发现这些发生变化的蛋白之间是否存在已经报道的或者预测的相互作用。用 WebGestalt中的Disease Association Analysis工具对这些差异表达的基因进行预测，以探索它们与疾病的可能关系。用TMHMM Server v.2.0预测了差异表达蛋白的跨膜结构域。分析结果显示，在相对应的两次正反标记实验中，分别鉴定到肽段数为30488和29309，蛋白数为4705和4435，重复鉴定到3703个蛋白，其中，在两次实验中均有定量信息的蛋白有3182个。鉴定到的蛋白涉及代谢途径、小分子代谢、蛋白质结合以及细胞外泌体。统计学分析显示，两次实验的均值为1.0188和1.0068，标准差为0.25133和0.17903。两次实验的数据分布直方图的偏度的标准误差均为0.043，峰度的标准误差均为0.087，两组数据的双侧T检验P值＜0.01，说明数据均符合正态分布。两组数据的Pearson相关系数为0.414，说明两组数据相关性良好，符合实验要求。
　　选择蛋白表达量上下调范围为均值的1.3倍，作为Gal3CB处理后，HepG2中表达出现变化趋势的蛋白。在这个标准下，有35个蛋白的表达量发生了上调，67个蛋白的表达发生了下调。其中，上调达到均值1.5倍的蛋白有11个，下调达到1.5倍的蛋白有24个。这些蛋白总的差异表达趋势是，负调控细胞生长或细胞黏附的蛋白表达量是明显上调的，正调控细胞生长或细胞黏附的蛋白的表达量是明显下调的，符合本论文第二部分的细胞生物学结论。
　　String10分析发现，与GalCB存在相互作用或者可能发生相互作用的蛋白，大部分都与肿瘤生长与转移相关。WebGestalt分析结果显示，Gal3CB刺激下表达发生差异变化的蛋白可以分为两组。一组与代谢相关疾病存在密切关系，另一组则与肿瘤相关。NDRG1不仅与肿瘤密切相关，也肝移植有密切关系，说明其可能与肝脏肿瘤存在关系。TMHMM Server v.2.0预测结果显示，在上调表达的蛋白中，有7个蛋白至少具有单次跨膜结构，在下调表达的蛋白中，至少具有单次跨膜结构的蛋白有16个，其中ALCAM是一个下调表达的跨膜蛋白，并与肿瘤密切相关。对鉴定到的差异表达蛋白进行免疫印迹验证，结果显示，NDRG1、CLU以及ALCAM的下调表达以及S100A11、MVP和Galectin-1的上调表达均与定量蛋白质组学的鉴定结果相符合。已有的研究证实，NDRG1、CLU以及ALCAM的下调表达以及S100A11的上调表达会导致HCC细胞生长和转移的抑制，这与之前的研究结论相符合。同时，在这些蛋白中，NDRG1对抗肿瘤药物达沙替尼的敏感度最大。
　　第三部分的研究结果显示，通过研究Gal3CB处理HepG2细胞后的蛋白质表达谱的动态变化，发现了Gal3C负调控细胞生长的功能可能是通过调节NDRG1、CLU、ALCAM、S100A11、MVP以及Galectin-1等的表达量实现的。并发现Gal3C抑制肿瘤细胞生长转移的机制与达沙替尼具有一定的一致性。
　　本课题主要取得了一下创新性发现：
　　1）利用代谢标记对Gal3C进行光反应活性氨基酸标记，使之具备了光反应交联能力，实际成为了一个研究Galectin-3配体的生物探针；
　　2）首次证实细胞外Gal3C是一个HepG2的生长和转移的负调控因子；
　　3）发现并初步阐述了细胞外Gal3C抑制细胞生长和转移的机制，细胞外Gal3C能够调控与HepG2转移相关的靶基因，NDRG1、CLU、ALCAM、MVP、S100A11以及Galectin-1的表达，并发现NDRG1对抗肿瘤药物达沙替尼的敏感度很高；
　　4）发现了一组未经报道过的Galectin-3在HCC细胞表面的潜在受体群。
　　本论文的研究结论使我们获得了Gal3C调控HCC生长和转移机制的较为清晰的认识。细胞外Gal3C能够结合到HepG2细胞表面，从而抑制HCC的生长和转移。Gal3C对HepG2的生长和转移的调控机制可能包括：1）直接影响细胞表面的粘附分子如ALCAM的表达；2）抑制细胞内的能量代谢水平；3）调控细胞内与生长和转移的相关基因，如 NDRG1、S100A11等的表达。
　　Gal3C对 HCC的调控是多方向，其详细机制仍然具有深入研究的价值。本论文仅从生物学和蛋白质组学角度，对其现象进行了阐述并对其机制进行了初步的研究，获得了一些有价值的结论。Gal3C对HepG2发挥负调控抗作用，预示其可能具有抗HCC的潜力。如何利用Gal3C的这种特性来指导HCC的临床诊断和治疗，是一个值得深入探讨和研究的领域。

目录

声明

缩略词表

第一章 绪论

1.1肝癌与肿瘤转移

1.2半乳凝集素-3与肿瘤

1.3 光反应活性交联剂与代谢标记

1.4 HCC的定量蛋白质组学研究进展

1.5 立题依据以及研究内容

第二章 Gal3C在HepG2表面的配体研究

2.1 前言

2.2 材料与方法

2.3实验结果

2.4 小结与讨论

第三章 Gal3C对HepG2细胞生存与转移的调控

3.1 前言

3.2材料方法

3.3 实验结果

3.4 小结与讨论

第四章 Gal3CB刺激HepG2细胞的定量蛋白质组学研究及验证

4.1前言

4.2材料与方法

4.3实验结果

4.4 小结与讨论

全文总结

参考文献

攻读博士期间发表的文章

个人简历

致谢

附录