建立CRISPR敲除造血干细胞CCR5基因治疗艾滋病新策略

摘要

艾滋病是全球性的公共卫生问题和社会问题。目前的主要治疗手段是抗逆转录病毒治疗，这种手段能够有效地控制艾滋病，但不能彻底清除潜伏状态的HIV病毒，并伴有严重的耐药性问题。因此，科学家们不得不寻找新的抗艾策略。2007年，德国医疗小组将CCR5(C-C chemokine receptor type5)基因缺陷的造血干细胞移植给一名患有白血病的艾滋病患者，经过长达7年的观察与检测未发现HIV病毒及相关症状。这一案例提示我们 CCR5可能是艾滋病治疗的理想靶点。另外，由于造血干细胞（Hematopoietic stem cell，HSC）移植在临床上得到成熟的应用，可以治疗多种造血统肿瘤及免疫相关疾病，这一技术为基因治疗提供了优秀的平台。因此，本研究拟建立基于造血干细胞CCR5基因敲除的技术平台，并结合造血干细胞移植建立功能性治愈艾滋病的新策略。
　　为完成功能性治愈艾滋病的临床前研究，本文将针对多方面的内容进行深入探索。本课题将建立高效特异的CRISPR（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats）技术平台，对HSC上的HIV辅助受体基因CCR5进行特异性敲除，并利用人源化免疫系统小鼠HIV感染模型初步探索该策略的安全性和有效性。CRISPR系统由两部分组成：介导识别的sgRNA（single guide RNA）和负责切割的Cas9蛋白。CRIPSR具有切割效率高和操作简便的特点，本文需要针对每个位点设计gRNA即可，Cas9蛋白则是通用的。首先在细胞系中筛选出具有高效切割能力、靶向CCR5基因的CRISPR/sgRNA；然后利用免疫缺陷小鼠模型验证该基因编辑体系的安全性和有效性；通过HIV攻毒实验该策略对HIV病毒感染的抵御能力；最后，针对临床前研究的需求从多方面检测该基因编辑体系的常规安全性。本文将得到经过安全性验证的、具有抵抗HIV感染能力的CCR5基因靶向的CRISPR基因修饰体系，为该疗法进入临床研究和应用打下了坚实的基础。
　　本课题将以CCR5为靶点，联合CRISPR/Cas9技术和造血干细胞移植治疗方案，建立功能性治愈艾滋病的新策略，以期建立一种更为安全和有效的艾滋病治疗技术。首先，本文中设计和构建多个靶向CCR5基因的 gRNA表达载体，建立高度纯化、无内毒素Cas9和gRNA载体，建立导入细胞的技术方法以及靶基因诱变效率检测系统。其次，优化人造血干/祖细胞（Hematopoietic Stem/Progenitor Cells， HSPCs）的分离纯化方案。另外，建立造血干细胞基因敲除及效率检测平台。然后，基于免疫缺陷小鼠优化人源化动物模型，建立具有高度造血系统人源化的小鼠模型以及HIV病毒感染与检测技术体系。接下来，筛选出诱变效率高、特异性好、可赋予细胞HIV-1抗性的CCR5靶向CRISPR。最后，在CCR5诱变造血干细胞移植小鼠模型上检测评估对HIV-1感染的抵抗作用，检测病毒载量、CD4+T细胞计数与对照组的差异，并观察小鼠体内CCR5突变细胞的选择富集效应。
　　本文针对人CCR5基因设计了45个sgRNA。将CRISPR/Cas9体系所需质粒采用核转染的方法转染到K562细胞中，经过2–3天的培养后提取基因组并PCR扩增CCR5基因上的对应修饰片段，用T7E1酶切和测序的方法检测该基因的切割效率。经检测，CRISPR切割效率可以达到50％左右。选取最优的CRISPR进行后续的造血干细胞转染实验。通过对现有CRISPER系统进行优化，将两个gRNA导向Cas9对靶序列进行双链切割，从而提高靶序列的敲除效率。在同一批次的CD34+细胞中，优化后的体系对CCR5序列的切割效率可高达32%。
　　本文开展了CCR5基因修饰后的人HSPCs的初步安全性评价。
　　（1）通过软琼脂培养法检测经过基因编辑处理的细胞是否具有类似于肿瘤细胞和转化细胞系的生长能力，结果表明修饰后的细胞与正常细胞相似，在软琼脂悬浮状态下不能扩增生长。通过与对照组进行比较，癌细胞增殖明显，而CCR5基因修饰的CD34+细胞并未出现增殖迹象，证明其不具有体外致瘤性。
　　（2）在裸鼠体内成瘤性评价实验中未检测到淋巴瘤及其症状。
　　（3）通过染色体核型检测，实验组CCR5基因修饰的CD34+细胞并未检测出核型异常。
　　（4）通过豚鼠过敏试验，实验组CCR5基因修饰的CD34+细胞在动物体内输注并未出现过敏症状，对照组输注BSA的动物体内均出现明显的过敏症症状。
　　CCR5基因修饰后的CD34+细胞能够在免疫缺陷小鼠中重建人的造血细胞并在其中检测到CCR5敲除。修饰后的CD34+ HSPCs移植到免疫缺陷小鼠体内，8周后开始检测移植小鼠的外周血中CD45+细胞占淋巴细胞的比例，分别进行8周，10周，12周及16周的定期检测。人的CD45细胞长期平均重建效率达40%，最高达90%。同时本文在移植后12周的小鼠外周血检测到32.2%的CCR5敲除比例。为了进一步评价CCR5的缺失在具有长期重建能力的HSC中的比例，本文针对移植后30–47周的小鼠和二次移植的小鼠进行外周血取样，分别检测到31.2%和24.7%。另外，本文成功的实现了CCR5嗜性的BaL-1毒株在人源化小鼠的长期、有效的感染。病毒感染的小鼠的病毒载量达到预期水平，且保持长期稳定。为了检测该策略在体内的抗病毒效果，本文对移植修饰后的CD34+细胞12周左右的小鼠进行Bal-1病毒感染，在感染后2、4、6、8周检测病毒载量变化。与对照组相比，实验组小鼠病毒载量在第8周明显下降。同时，攻毒前后CD4+T细胞明显富集，CCR5敲除比例明显升高。
　　总之，本文在体外和体内水平实现了高效的 CCR5基因敲除。本文通过在人CD34+细胞中实现CCR5基因高效、特异性敲除。其次，本文将体外修饰的CD34+细胞移植到小鼠体内，能够高效重建出人的造血系统，证明体外修饰策略不会影响到造血干细胞的重建能力。另外，在免疫缺陷小鼠体内重建的人的外周血单核细胞中检测到CCR5基因敲除，实现了在体内评价体系中敲除CCR5基因的目的。此外，本文在体内、体外水平完成了常规性安全实验，初步探索了本策略的安全性。在进行临床试验之前，本文对该治疗策略的安全性方面做初步的评估，提示我们利用CRISPR技术在CD34+细胞上实现CCR5基因敲除是一种安全的基因修饰方案。人源化小鼠攻毒实验结果显示，在小鼠感染R5噬性HIV-1病毒第8周对照组小鼠病毒载量处于较高水平，而CCR5基因修饰的实验组小鼠病毒载量明显下降。该实验结果表明利用CRISPR修饰造血干细胞CCR5基因重建的人源化小鼠具有抵御HIV-1病毒感染的能力。因此，本研究表明基于CCR5基因敲除治疗艾滋病的新策略能够在体内安全、有效的控制HIV病毒的载量，具有转化到临床研究的重要价值。

目录

声明

英文缩略词表

前言

1. 国内外研究现状

2. 立体依据与研究方案

3. 研究目标与意义

第一部分 建立靶向人CCR5基因的CRISPR/Cas9基因编辑体系

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第二部分 在人HSPC上高效敲除CCR5基因

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第三部分 在免疫缺陷小鼠中评价HSPC上的CCR5基因编辑

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第四部分 CCR5敲除对抵抗HIV-1感染的作用

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

第五部分 临床研究前的安全性评价

1. 材料与方法

2. 结果

3. 讨论

结论

参考文献

附表

附表1 sgRNA序列信息

附表2 sgRNA配对信息

发表论文

个人简历

致谢