新城疫病毒ClassⅠ型毒株分子特性分析及荧光定量RT-PCR检测方法的建立

摘要

新城疫是由禽副粘病毒Ⅰ型（新城疫病毒，NDV）引起的主要感染禽类的一种急性、高度接触性、致死性传染病，对养禽业危害巨大，被世界动物卫生组织(OIE)规定为法定报告疫病。
　　 根据新城疫病毒基因组特性可以将新城疫病毒分为两类:Ⅰ类(ClassⅠ)和Ⅱ类(ClassⅡ)，两类不同NDV在基因组特性和抗原性差异显著。目前鉴定的NDV基因组长度包括15186、15192、15198nt三种。Ⅱ类新城疫病毒可分为Ⅰ～Ⅸ九个基因型，其中基因Ⅶ型分离株被认为是引起世界范围内新城疫第四次大流行的主要病原体。Ⅰ类新城疫病毒可分为1～9共9个基因型，主要存在于野生水鸟、水禽以及活禽市场中，近年来我国大陆从水禽及活禽市场中也分离到了此类毒株。
　　 国内NDV分离株的的分子流行病学分析证实我国目前同时存在Ⅰ类和Ⅱ类新城疫病毒，Ⅱ类NDV中的基因Ⅶ型毒株是引起我国NDV发生和流行的主要病原体，因此建立快速、敏感、特异性强的快速诊断方法对早期发现病原至关重要。此外，Ⅰ类NDV作为新近出现的分离株，之前建立的各种分子检测方法不能同时检测两类NDV，因此建立一种能同时检测两类NDV的分子诊断技术也具有重要意义。
　　 本研究通过对我国分离的13株Ⅰ类NDV分离株M基因的序列测定和一株Ⅰ类NDV代表株基因组序列测定和分析，为建立NDV通用型荧光定量RT-PCR检测方法奠定了基础。结果显示，13株Ⅰ类NDV分离株分属于基因2、3型，其M基因均由1241个核苷酸组成，共编码349个氨基酸。Ⅰ类NDV代表株NDV08-046的基因组长度为15198nt，具有典型的Ⅰ类NDV基因组特征，符合副粘病毒复制的“六碱基原则”。在P基因编码区有12nt的插入。且与Ⅱ类NDV毒株不同，其HN基因编码585个氨基酸。本研究结果为我国ClassⅠ型NDV的遗传进化分析提供重要依据。
　　 本研究根据测定的Ⅰ类NDV分离株M基因序列和GenBank中发表的Ⅱ类NDV代表株M基因的分子特征，选择M基因5'高度保守的区域作为靶基因分别设计了一对引物和探针，初步建立了能同时检测Ⅰ类和Ⅱ类新城疫病毒的通用型荧光定量RT-PCR检测方法。通过对反应体系进行优化，其最低可检测10个拷贝/uL的模板RNA，比普通RT-PCR敏感性高100倍，特异性试验表明仅NDV毒株能被检出。对近年来国家新城疫参考实验室分离保存的64株NDV进行检测结果表明，所建立的方法对两种类型的NDV有良好的适用性。
　　 本研究根据GenBank中发表的基因Ⅶ型NDV相关F基因分子特征，选择了F基因裂解位点区域分别设计一对引物和探针，初步建立了基因Ⅶ型NDV荧光定量RT-PCR检测方法。通过对反应体系进行优化，最低可检测102拷贝/uL的模板RNA，比普通RT-PCR敏感性高100倍，特异性试验表明仅基因Ⅶ型NDV毒株有特异性扩增曲线。通过对近年来国家新城疫参考实验室分离保存的64株NDV进行检测结果表明，所建立的方法对基因Ⅶ型NDV有良好的鉴别检测效果。

目录

摘要

英文缩写词表

文献综述

前言

1 新城疫病毒研究进展

1．1 新城疫病毒特征

1．2 新城疫病毒的分子生物学特性

2 新城疫流行概况

2．1 世界范围的流行

2．2 我国新城疫流行概况

3 新城疫病毒诊断技术

3．1 常规诊断技术

3．2 分子生物学诊断技术

试验一 ClassⅠ型新城疫病毒分离株基质蛋白基因序列特性分析

1 材料与方法

1．1 生物材料

1．2 主要试剂及仪器

1．3 引物设计

1．4 病毒RNA的提取

1．5 RT-PCR扩增M基因全长

1．6 PCR产物电泳鉴定

1．7 PCR产物回收纯化

1．8 M基因序列拼接及同源性分析

1．9 遗传进化树构建

2 结果

2．1 ClassⅠ型NDV毒株M蛋白基因的扩增及测序结果

2．2 ClassⅠ型NDV毒株M基因遗传进化分析

3 讨论

试验二 一株ClassⅠ新城疫病毒分离株全基因组序列测定及分析

1 材料与方法

1．1 生物学材料

1．2 主要分子生物学试剂

1．3 引物设计

1．4 RNA提取及RT-PCR扩增主要区域序列

1．5 3’RACE及5’RACE扩增基因组末端序列

2 结果

2．1 电泳结果

3 全基因组序列分析

3．1 各基因位置及序列分析

3．2 主要区域序列分析

3．3 F基因遗传进化分析

3．4 基因间隔区序列分析

4 讨论

试验三 新城疫病毒通用型荧光定量RT-PCR检测方法的研究与应用

1 材料与方法

1．1 生物材料

1．2 主要试剂及仪器

1．3 引物及探针设计

1．4 体外转录模板的制备

1．5 荧光定量RT-PCR检测体系的建立

2 结果

2．1 cRNA标准品的制备

2．2 荧光定量RT-PCR反应条件

2．3 标准曲线的建立

2．4 荧光定量RT-PCR敏感性试验

2．5 荧光定量RT-PCR重复性试验

2．6 荧光定量RT-PCR特异性试验

2．7 荧光RT-PCR与普通RT-PCR比对试验

2．8 cRNA标准品的稳定性试验

2．9 临床样品的检测

3 讨论

试验四 基因Ⅶ型新城疫病毒荧光定量RT-PCR检测方法的研究与应用

1 材料与方法

1．1 生物材料

1．2 主要试剂及仪器

1．3 引物及探针设计

1．4 体外转录模板的制备

1．5 荧光定量RT-PCR检测体系的建立

2 结果

2．1 cRNA标准品的制备

2．2 荧光定量RT-PCR反应条件

2．3 标准曲线的建立

2．4 荧光定量RT-PCR敏感性试验

2．5 荧光定量RT-PCR重复性试验

2．6 荧光定量RT-PCR特异性试验

2．7 荧光RT-PCR与普通RT-PCR比对试验

2．8 cRNA标准品的稳定性试验

2．9 临床样品的检测

3 讨论

全文总结

参考文献

致谢

攻读硕士期间发表的论文

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