一个新的评价药物肾毒性的细胞模型的建立——稳定表达绿色荧光蛋白（EGFP）的HK-2细胞

摘要

本文研究目的：建立体外药物肾毒性早期预测细胞模型，确立快速、简便、连续、直观的观察指标与检测终点，应用于肾毒性药物的早期预测，进行高通量筛选，为新药研发早期毒性评价提供技术方法。 研究方法： 1.观察庆大霉素在体外对肾小管上皮细胞内HSP70表达的影响将庆大霉素(100μg/ml)作用于人肾小管上皮细胞系(HK-2)。 1.1用MTT法检测庆大霉素对HK-2细胞增殖活力的影响。 1.2庆大霉素所致HK-2细胞损伤分光光度法测定乳酸脱氢酶(LDH)活性、N-乙酰-β氨基葡萄糖苷酶(NAG)酶含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性以及丙二醛(MDA)含量。 1.3庆大霉素所致HK-2细胞损伤时，HSP70表达的变化应用免疫细胞化学和western-blotting法观察了HSP70蛋白表达的改变，采用RT-PCR法检测HSP70mRNA表达的变化。 2.稳定表达绿色荧光蛋白(EGFP)的HK-2细胞株的建立。 2.1应用基因重组技术，构建HSP70启动子基因与报告分子EGFP(增强型绿色荧光蛋白)基因的融合基因真核表达载体pHSP70B-EGFP； 2.2利用脂质体转染法将该重组表达载体转染入HK-2细胞，经过有限稀释法和G418压力选择，应用荧光显微镜和RT-PCR检测，获得可稳定表达EGFP蛋白的HK-2细胞克隆。 2.3稳定表达EGFP蛋白的HK-2细胞克隆的生物学鉴定。 2.3.1MTT法测定转染后HK-2细胞生长曲线。 2.3.2应用PMP柱前衍生化HPLC法测定细胞对葡萄糖的摄取能力变化 3.稳定表达EGFP的HK-2细胞预测药物肾毒性的有效性验证。 3.1对稳定表达EGFP的HK-2细胞进行热休克诱导(43℃，30min)，荧光显微镜和流式细胞仪观察细胞内荧光强度变化；western-blotting法观察EGFP蛋白表达的改变；RT-PCR法检测EGFPmRNA表达的变化。 3.2激光共聚焦显微镜观察不同肾毒性药物导致细胞内荧光强度变化，确定不同药物(庆大霉素、环孢素A、顺铂、马兜铃酸、阿霉素、对乙酰氨基酚、新霉素、两性霉素B、乙二醇、DMSO)的IC50和细胞荧光强度增加一半时的药物浓度，即FC50，并检验二者的相关性。 研究结果： 1.MTT结果显示：HK-2细胞加入庆大霉素24h后，细胞增殖显著被抑制(P＜0.01)。48h至96h后，庆大霉素组HK-2细胞增殖均显著低于对照组HK-2细胞。HK-2细胞加入庆大霉素24h后，LDH活力、MDA和NAG酶含量显著升高(P＜0.01);SOD活性显著降低(P＜0.01)；应用免疫细胞化学方法，HK-2细胞加入庆大霉素24h后，HSP70表达阳性率显著升高(P＜0.01)。还可使HSP70蛋白和mRNA表达增加(P＜0.01)，并持续至96h。由此确定可采用HSP70启动基因作为构建真核表达载体所需的启动子。 2.构建了HSP70启动子基因与报告基因EGFP基因的融合基因真核表达质粒pHSP70B-EGFP;通过含有不同G418浓度梯度的培养液培养HK-2细胞，确定了筛选用G418工作浓度为200μg/ml；利用脂质体法将该重组表达载体转染入HK-2细胞，经过有限稀释法和G418压力选择，获得可稳定表达EGFP融合蛋白的HK-2细胞克隆。应用荧光显微镜可观测到细胞内有绿色荧光蛋白，RT-PCR检测到细胞内的EGFP基因。MTT法与PMP柱前衍生化HPLC法检测表明，未转染HK-2细胞相比，转染了pHSP70B-EGFP的HK-2细胞增殖能力和摄取葡萄糖的能力明显下降 3.未转染pHSP70B-EGFP的HK-2细胞内的荧光非常微弱，而转染后的细胞可明显观察到荧光。当细胞被热休克(43℃，30min)后，细胞内荧光明显增强。Western-blotting和RT-PCR方法结果进一步证明：转染后的细胞可表达EGFP。当细胞被热休克(43℃，30min)后，细胞内表达EGFP显著增加。庆大霉素作用于转染后的HK-2细胞，结果表明，随着浓度的增加和时间的延长，细胞内荧光逐渐增强。应用10种已知的肾毒性不等的药物作用于此细胞模型，分别测定IC50和FC50，IC50和FC50相关性较好。因此，可通过观察细胞内荧光变化预测药物肾毒性。 研究结论： 1.庆大霉素在损伤人肾小管上皮细胞系(HK-2)的同时，可显著增加HSP70的表达，且损伤程度与HSP70表达量正相关。 2.成功地构建了pHSP70B-EGFP真核表达载体，并将其转染入HK-2细胞，建立了稳定细胞株。pHSP70B-EGFP转基因HK-2细胞保留了肾小管上皮细胞的重吸收葡萄糖的能力。虽然此细胞株增殖能力和对葡萄糖的摄取等功能显著降低，但细胞内荧光强度的改变可以较好地反映细胞损伤程度。 3.本研究建立了一种新的细胞毒性检测终点——荧光强度增加一半时的药物浓度，即FC50。通过已知10种不同肾毒性的药物毒性研究，结果表明IC50和FC50有较好的相关性，即可用FC50预测IC50。 4.pHSP70B-EGFP转基因HK-2细胞模型用于体外早期预测药物毒物的肾毒性，方法简便、快速，检测终点直观，且可连续观察毒性的时效关系。可望用于药物肾毒性的高通量筛选，在动物毒性试验前进行肾脏毒性预测，可缩短研发周期，节约动物用量，降低药物研发成本。

目录

独创性声明及保护知识产权声明

缩略语表

文献回顾

前言

实验研究

第一部分 庆大霉素导致肾小管上皮细胞损伤与热休克蛋白70表达的升高

第二部分 稳定表达EGFP的HK-2细胞株的建立

第三部分 稳定表达EGFP的HK-2细胞的有效性验证

小结

参考文献

个人简历

博士期间完成的论文