国内首例异体颜面组织移植受者他克莫司和霉酚酸酯的个体化用药研究

摘要

肢体异体移植、大面积皮肤异体移植之所以不能广泛成功开展的主要障碍是术后极易发生免疫排斥反应，排斥反应的发生使移植器官和组织不能长期有功能性的存活，甚至腐烂坏死。2005年法国实施的全球首例颜面部复合组织异体移植在全球引起了强烈的社会反响，但术后第21天发生了急性排斥反应。2006年4月，西京医院成功完成国内首例颜面部复合组织异体移植，移植了包括皮肤、表情肌、上唇全层和鼻的全组织，并吻合了动脉、颈外静脉和面神经，其难度和复杂程度远难于法国完成的异体颜面组织移植。作为皮肤复合组织移植的受者，术后出现排斥反应的几率很高，排斥反应发生的程度和频率将直接影响移植组织能否长期存活及功能能否及时恢复，而免疫抑制剂的个体化用药是否合理又直接影响术后免疫排斥反应发生的频率和程度，因此为受者“量体裁衣”制定免疫抑制剂术后个体化给药方案，是保证移植组织或器官有功能性的长期存活的关键因素之一。 迄今为止，异体颜面组织移植术后抗排斥反应的个体化给药方案的研究国内尚属首次，国外也尚无成熟的经验可以借鉴，本试验将通过对霉酚酸酯和他克莫司在国内首例异体颜面组织移植受者体内药动学特征的研究，对受者实施个体化给药，避免移植术后出现严重的排斥反应或毒性反应。 目的：基于他克莫司和霉酚酸酯临床药动学的特征及规律对国内首例颜面部复合组织异体移植受者实施个体化用药，保证免疫抑制剂的治疗窗在安全有效的范围内，避免因免疫抑制剂用量不足引起的排斥反应和免疫抑制剂用量过度引起的毒性反应。 方法：本试验分三部分。 第一部分：建立灵敏度高、专一性强、准确性好的免疫抑制剂他克莫司和霉酚酸的检测方法。本试验首先建立了特异性强、灵敏度高、准确性好以及稳定性高的微粒子免疫（EMIA）法测定全血中他克莫司（FK506） 血药浓度的分析方法学，并通过对方法特异性、精密度、准确度、线性范围以及定量检测限等效能指标的考核对方法学进行评价。测定步骤：精密量取混和均匀的全血样品150 Μl, 精密加入150 Μl蛋白沉淀剂（硫酸锌的甲醇、异丙醇溶液），取上清液200 Μl进行他克莫司全血浓度的测定；测定采用Mode 1 方式，同时加入高、中、低不同浓度的他克莫司质控样品。其次是建立专一性强、灵敏度高、准确性好以及经济性强的高效液相（HPLC） 法测定血浆中霉酚酸（MPA）浓度的分析方法，并通过对方法特异性、精密度、准确度、稳定性、回收率、线性范围以及定量检测限等效能指标的考核对方法学进行评价。色谱条件色谱柱：Irregular C18 (250 mm×4.6 mm, 5μm); 保护柱：Agilent Eclipse C18 （12.5 mm×4.6 mm, 5 μm）; 流动相：甲醇?10 mmol·L-1 K2HPO4缓冲液（68:32，v/v; 5 mmol·L-1 四丁基溴化铵），流速为1.0 Ml·min-1，检测波长：210 nm; 柱温：25°C。 第二部分：研究免疫抑制剂他克莫司和霉酚酸酯在颜面部复合组织异体移植受者体内的药动学，意在揭示他克莫司和霉酚酸酯在受者体内的吸收、代谢、排泄等特征及规律并以此为依据制定初步的给药方案。他克莫司药动学的研究：采用微粒子免疫（EMIA）法测定全血中他克莫司的浓度。口服他克莫司（FK506）达稳态后，在服药前及服药后0.25，0.5，0.75，1，1.5，2，2.5，3，4，6，8，12 h分别抽取受者静脉血2 Ml，置于EDTA抗凝试管中，4°C冰箱保存待测。霉酚酸酯药动学：采用高效液相色谱法（HPLC）测定血浆中霉酚酸酯的活性代谢霉酚酸（MPA）浓度。口服霉酚酸酯达稳态后，在服药前及服药后0.25，0.5，1，1.5，2，2.5，3.5，5.5，7.5，11.5 h 分别抽取受者静脉血2 Ml置于肝素抗凝试管中，-20°C冰箱保存待测。采用DAS2.0软件计算药动学参数，Tmax、Cmax采用实测值，以梯形法求得曲线下面积AUC。 第三部分：评价、调整和优化他克莫司和霉酚酸酯的给药方案，归纳总结出颜面部复合组织异体移植受者术后免疫抑制剂安全有效的治疗窗。 结合他克莫司和霉酚酸酯在颜面部复合组织异体移植受者体内药动学特征、实验室指标、病理活检以及受者移植组织恢复情况评价、调整和优化免疫抑制剂的给药方案，实施个体化用药，探索出术后不同时期他克莫司安全有效的治疗窗，避免因免疫抑制剂用量不当引起的免疫排斥及毒性反应的发生。 结果： 1. 本试验采用EMIA法测定全血中他克莫司的浓度，最低检测限为3ng·Ml-1，线性范围为3～30 ng·Ml-1，在此线性范围内盒内精密度RSD均小于12.7％，准确度在94.3～100.8％之间；不同药盒间精密度RSD也均小于11.1％，准确度在92.2％～101.7％之间。 2. 本试验采用HPLC法测定血浆中霉酚酸酯活性代谢产物霉酚酸的浓度，霉酚酸峰形良好，保留时间在7.45 min左右，实现了基线分离效果。最低检测限为0.5 mg·L-1，线性范围为0.5～32 mg·L-1，在此线性范围内批内、批间精密度RSD均小于10％，准确度在94.8～109.0％之间；回收率均在79.72～84.89％之间；稳定性RSD均小于4.6％。 3. 颜面部复合组织异体移植受者他克莫司药动学特征：口服他克莫司达稳态时，其主要的药动学参数为：Tmax为1.5 h，Cmax为51.4 ng·Ml-1，T1/2为13.4 h，AUC0~12为600.58 ng·Ml-1·h-1。 4. 颜面部复合组织异体移植受者霉酚酸药动学特征：口服霉酚酸酯达稳态时，其主要的药动学参数：Tmax为0.5 h，Cmax为12.42 mg·L-1，T1/2为0.51h，AUC0~11.5为13.31 mg·L-1·h-1。 5. 颜面部复合组织异体移植采用“四联”用药方案，即他克莫司+ 霉酚酸酯+皮质激素+ 塞尼哌。术中静脉滴注他克莫司针剂和甲基强的松龙（MP） 冲击，以期尽快达到预期浓度，避免术后出现超急性排斥反应。术后第1 日给予MP 250 mg，每日递减40 mg 至130 mg，第5 日改服强的松80 mg，每日逐渐递减15 mg，维持在25 mg/d；术后3 d 他克莫司开始剂量为13 mg/d, 分2 次口服，以后依据他克莫司血药浓度、临床诊断以及病理活检及时调整给药剂量，由原来的13 mg/d 下调到11 mg/d，再下调到8 mg/d，再下调到4 mg/d，最后调到1 mg/d；霉酚酸酯（MMF） 开始剂量为1000 mg/d，逐渐增加剂量到1500 mg/d，最后减量到750mg/d；塞尼哌为术后辅助用药。 6. 他克莫司的治疗窗术后第1 个月为20.12±4.77 ng·Ml-1；术后第2~3 月为20.17±4.02 ng·Ml-1；术后第4~6 月为22.82±7.10 ng·Ml-1；术后第7~12月为27.88 ±5.68 ng·Ml-1。病理活检和实验室检查结果显示他克莫司和霉酚酸酯的剂量控制在安全有效的治疗窗内，移植术后未出现严重的排斥反应和明显的免疫抑制剂的毒副作用。 结论： 1．建立了灵敏度高、专一性强、准确性好及稳定性高的EMIA 法测定全血中他克莫司浓度的分析方法学。建立了专一性强、准确性好、稳定性以及回收率良好的HPLC 法测定血浆中霉酚酸浓度的分析方法学。 2．建立了他克莫司在中国首例异体颜面组织移植受者体内的药动学模型： 其达峰时间Tmax为1.5 h左右，消除的半衰期T1/2为13.4 h，与普通人群的药动学特征基本符合。他克莫司在此受者体内属于慢速消除类型的药物，根据其生物半衰期T1/2 13.4 h设计给药方案：每天早晚两次给药。 3．建立了霉酚酸酯在中国首例异体颜面组织移植受者体内的药动学模型： 其达峰时间Tmax为0.5 h左右，消除半衰期T1/2为0.51 h，与普通人群的药动学特征基本符合。霉酚酸在该受者体内迅速消除，属于超快速消除类型的药物，根据其治疗指数高的特性设计给药方案。 4．建立了一套切实可行的适合中国首例颜面部复合组织异体移植受者的个体化给药方案。临床诊断各项指标显示该受者面部移植组织功能部分恢复。形态学上，该受者面部皮肤表面较光滑，色泽良好，未出现红肿、淤血、溃烂等临床表症；功能学上，移植的复合组织对于外界刺激机能反应部分恢复。