体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞分化为角膜上皮细胞的初步研究

摘要

研究背景与目的 角膜上皮再生的来源是角膜缘干细胞，干细胞的缺失会导致严重的眼表异常，包括角膜新生血管、角膜结膜化、角膜溃疡穿孔以及带状角膜病变等。 以自体或同种异体角膜缘移植，因供体来源不足及异体移植引起的排斥反应而受限；而单纯羊膜移植重建眼表，因无上皮再生来源的干细胞而不能治疗角膜缘严重受损的眼表伤。组织工程技术的发展为解决这一问题带来了希望。 尽管大量研究用角膜缘干细胞作为种子细胞，但细胞来源的有限性使其应用和推广受到限制。 研究表明，成年人骨髓中存在着多潜能性的间充质干细胞(mesenchymalstem cell，MSC)，在体外不同条件下可以定向地被诱导分化为心肌细胞、脂肪细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、骨、软骨、肌腱及骨髓基质等不同细胞。这类细胞来源确切、充足，取材方便，分化潜能大，避免了胚胎干细胞可能面临的伦理学问题，并且因为是自体组织，所以不存在排斥反应，可能具有更加良好的应用前景。 角膜基质是角膜上皮细胞和角膜缘干细胞的微环境，具有维持角膜上皮细胞特性的作用。角膜基质含有多种自分泌和旁分泌细胞因子及其受体，共同组成了角膜缘基质层复杂的细胞因子调控微环境，维持角膜缘干细胞的正常分化、繁殖和不进入终极分化。 本实验的目的是利用组织工程技术体外培养骨髓MSC，与角膜基质细胞共培养诱导骨髓MSC向角膜上皮细胞转化，通过对骨髓MSC向角膜上皮细胞分化潜能的研究，探讨骨髓间充质干细胞作为构建组织工程化角膜种子细胞的可行性及其重建角膜上皮的可能性。 方法 （1）采用Percoll密度梯度离心培养技术结合贴壁培养法对大鼠骨髓间充质干细胞分离、纯化和原代、传代培养观察，免疫细胞染色。 （2）对体外培养的大鼠骨髓MSC进行形态学观察、免疫荧光染色检测表面抗原标记，确认为培养的细胞为骨髓MSC。 （3）观察大鼠骨髓MSC在体外微环境诱导下，横向分化为角膜上皮细胞的情况。将分离培养的大鼠骨髓MSC与角膜基质细胞在Transwell体系中进行共培养，使用免疫荧光技术检测共培养前后细胞的分化情况。 结果 大鼠骨髓MSC可以在体外培养扩增，表现出很强的增殖潜能。免疫荧光染色显示，原代培养的骨髓MSC CD29阳性，CD34、CD45和CK12为阴性，流式细胞仪显示，CD29 阳性率为81.56 ％、CD34 为0.10 ％、CD44 为88.77 ％、CD45为0.17％，CD71为10.02％、CD90为98.43、CD133为1.56％。符合骨髓MSC的特征。骨髓MSC与角膜基质细胞共培养1wk后大部分细胞分化为间质细胞，少部分细胞形态上相对偏小，免疫荧光检测这部分细胞表达角膜上皮细胞特异性标志角蛋白CK12。 结论 体外培养的大鼠骨髓MSC在角膜基质细胞的诱导下具有横向分化为角膜上皮细胞的潜能，有可能作为角膜上皮组织工程种子细胞的选择。