导向性IFN-α2a-α-MSH基因的克隆、融合蛋白的表达、纯化及生物学活性的测定

摘要

目的：IFN-α2a是一种具有抗病毒、免疫调节和抗肿瘤活性等多种生物功能的细胞因子，已被FDA批准用于多种病毒性疾病和恶性肿瘤的治疗。但IFN-α2a在临床治疗中需大剂量长期给药，并且常常引发明显的毒副作用，严重制约着IFN-α2a的临床应用。 Α-MSH（SYSMEHFRWGKPV）是一种由多种细胞分泌的含13肽激素，是一种天然存在的多肽，可特异性的与黑素细胞及恶性黑色素瘤细胞表面的MC-1R结合，促进恶性黑色素瘤细胞的凋亡，并可通过皮肤基底膜的重建抑制皮肤恶性黑色素瘤的转移。研究表明所有黑素细胞和黑素瘤细胞都表达α-MSH受体MC-1R，且黑素瘤细胞表达MC-1R上调，人黑素瘤细胞表面MC-1R密度为900-5700个结合位点/每细胞，而正常状态下人表皮黑素细胞上MC-1R不超过100个结合位点/每细胞。本课题拟利用基因重组技术，构建导向性IFN-α2a-α-MSH融合基因表达载体，并在大肠杆菌中表达，制备一种治疗恶性黑色素瘤的靶向制剂。 方法：将本实验室已构建的pET-22b(+)IFN-α2a-NGR用BamH I和Sal I限制性内切酶进行双酶切，将得到的大片段与设计的α-MSH多肽片段退火后的产物进行连接，构建原核表达载体pET-22b(+)IFN-α2a-α-MSH，将序列鉴定正确的重组质粒转化入Rosetta-gamiTM2(DE3)大肠杆菌，IPTG诱导目的蛋白表达。对表达产物进行SDS-PAGE及Western Blot鉴定，疏水作用层析纯化蛋白。 建立小鼠恶性黑色素瘤模型，用得到的IFN-α2a-α-MSH蛋白对恶性黑色素瘤小鼠进行治疗，观察肿瘤体积变化，计算抑瘤率，并进行统计学分析。 结果：在大肠杆菌中成功实现了IFN-α2a-α-MSH的稳定、高效表达，表达产物以包涵体形式存在，采用超声裂菌的方法，用疏水作用层析技术获得较高纯度的重组蛋白。抑瘤实验结果显示IFN-α2a-α-MSH的抑瘤率明显高于IFN-α2a和对照组。 结论：成功构建了pET-22b(+)IFN-α2a-α-MSH表达载体，并得到稳定的原核表达菌株，纯化了IFN-α2a-α-MSH 融合蛋白。用该蛋白治疗恶性黑色素瘤小鼠肿瘤动物模型，获得了较高的抑瘤率，经统计学分析p<0.05 ，具有统计学意义。以上结果显示，IFN-α2a-α-MSH有可能成为治疗恶性黑色素瘤新制剂。