降钙素对小鼠牙齿萌出过程中破骨细胞分化因子RANKL表达的影响

摘要

牙齿萌出需要在牙胚的合方形成萌出通道,在这一过程中既有牙槽骨、牙胚的组织学改变,又有破骨细胞、成骨细胞、牙胚细胞等细胞学的改变；还有多种细胞因子的参与。破骨细胞是来源于骨髓单核细胞融合而形成的体积较大，具有极强的溶骨能力的多核巨细胞。破骨细胞能引起牙槽骨吸收，形成萌出通道。而与牙齿萌出相关的细胞因子及牙胚的发育，对破骨细胞的形成起到一定的调节作用。RANKL是一种肿瘤坏死因子超家族成员，具有调节破骨细胞增殖、分化、融合、激活和凋亡的作用，是破骨细胞生成的最终效应因子。而OPG竞争性抑制RANKL与RANK结合，从而消除RANKL对破骨细胞分化和活化，抑制骨吸收，增加骨量，降低血钙水平。RANKL/RANK/OPG三者形成了对破骨细胞分化、活化与凋亡的三角调节关系。
　　降钙素是由人体甲状腺C细胞分泌的多肽激素,属G蛋白偶联受体家族,可直接、快速而广泛地抑制骨吸收。以往研究认为降钙素对破骨细胞的作用是借助于破骨细胞膜上高亲和力降钙素受体，其基因的多态性与骨密度有关；氨基端功能区和e区是降钙素结合位点，第3、第6跨膜区是受体激活的关键部位。最近研究发现，应用骨保护素可以减少RANKL引起的破骨细胞的分化，应用降钙素也能有相同的作用。这提示降钙素可能也通过RANKL—RANK—OPG环路而起作用。
　　目前降钙素对牙齿萌出过程中破骨细胞和RANKL表达的相关研究，国内外文献报道较少。本研究通过体内和体外两个方面来探讨降钙素对破骨细胞RANKL表达影响，推测其对牙齿萌出过程中破骨细胞的调节作用，具体内容和结果如下：
　　实验一：降钙素对小鼠牙齿萌出过程中RANKL蛋白表达的影响。
　　同窝生后3d昆明小鼠10只,平均分成2组：降钙素组和对照组。两组动物均饲养7d,其中对照组于实验第1、2、3d皮内注射生理盐水,降钙素组于第1、2、3d皮内注射鲑鱼降钙素,1U/100g/d。所有动物于用药开始后7d脱颈处死。每只小鼠均取其下颌骨,40g/L多聚甲醛固定24h,甲酸甲酸钠脱钙液中40C脱钙3d，脱钙后,分切,修整,酒精脱水,二甲苯透明,浸蜡,石蜡包埋,制作5μm厚石蜡切片。应用酶组织化学染色，免疫组织化学染色的方法检测两组破骨细胞数量和RANKL蛋白的表达情况。结果：降钙素组破骨细胞数量明显少于对照组，RANKL蛋白的表达明显弱于对照组。提示降钙素除了与其受体直接作用外还通过RANKL—RANK—OPG环路抑制RANKL引起的破骨细胞的分化及功能。
　　实验二：降钙素对小鼠牙齿萌出过程中RANKLmRNA表达的影响
　　动物分组及用药同实验一，而后取其牙胚周围组织，进行逆转录-聚合酶链反应检测RANKLmRNA的表达情况。结果：降钙素组RANKLmRNA的表达明显弱于对照组，结合实验一的结果说明降钙素既能抑制RANKL蛋白的表达，又能抑制mRNA的表达，从而双重抑制破骨细胞的分化和功能。
　　实验三：降钙素对体外培养破骨细胞样细胞RANKL蛋白表达的影响利用破骨细胞贴壁快以及耐胰蛋白酶的特性，采用2.5g/L胰蛋白酶和2g/LI型胶原酶来分离纯化骨巨细胞瘤中的破骨细胞，培养2d后随机分为对照组和实验组，在实验组培养液中加入浓度为10－8mol/L的降钙素，以抗酒石酸酸性磷酸酶染色观察破骨细胞数目、形态，用免疫组化方法观察RANKL的表达。结果:1、从骨巨细胞瘤中分离纯化获得的破骨细胞数量较多、核多、纯度高；降钙素组破骨细胞数目较对照组明显减少(P<0.05)。2、降钙素组和对照组RANKL蛋白的表达未见明显差异。
　　实验四：降钙素对体外培养破骨细胞样细胞RANKLmRNA表达的影响
　　材料方法同实验三，收集细胞进行RT-PCR检测RANKLmRNA的表达。结果：降钙素组RANKLmRNA的表达明显弱于对照组，说明降钙素可能通过抑制RANKLmRNA的表达，从而抑制破骨细胞的分化和功能。

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文献回顾

1．降钙素的有关研究

2．破骨细胞的研究进展

3．牙齿萌出的机制

正文

实验一 降钙素对小鼠牙齿萌出过程中 RANKL 蛋白表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 降钙素对小鼠牙齿萌出过程中 RANKLmRNA表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 降钙素对体外培养破骨细胞 RANKL蛋白表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 降钙素对体外培养破骨细胞 RANKLmRNA 表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢