聚氨酯人耳廓形态支架快速成型及利用软骨细胞/支架复合体构建耳廓形态软骨

摘要

全耳廓重建依然是颌面缺损修复最大的挑战之一。虽然耳廓只占身体表面很小的比例但它却是身体外部具有最复杂三维结构的器官。很多年以来，通过整形手术建造非常满意的外耳已经成为难以企及的目标。
　　目前临床中耳廓修复方法包括赝复体修复和外科手术。赝复体修复简单快速，价格低廉。但是存在材料老化变色、固位困难等问题。外科手术植入物有人工假体和自体肋软骨两种，对于这两种手术方法一直存在争议。人工假体的优点是植入体为预定形态，缩短了手术时间；主要缺点是假体外露及导致的感染。自体肋软骨是应用最为广泛并作为全耳重建的首选材料，但是再造耳外形与对侧耳廓不一致，手术操作时间长以及患者胸廓损伤畸形是自体肋软骨移植的缺点。
　　组织工程耳廓软骨的研究成为替代上述耳廓重建可能的方法，也是目前组织工程软骨研究的热点和难点之一。以往的研究者在裸鼠体内或是体外培养构建了组织工程耳廓形态软骨，但是随着时间的延长都或多或少发生了变形；由于支架降解产物的影响以及免疫排斥反应组织工程耳廓同种异体移植后耳廓原始形态将被破坏。组织工程耳廓重建的目标不仅仅是形成软骨而且要尽可能形成精细的三维形态并且不随时间而变形。实际上，至今还没有合适的组织工程耳廓软骨能够替代正常耳廓软骨的弹性和形状。因此，要解决上述几种耳廓重建方法的缺点，构建精确形态并且不随时间而变形的耳廓软骨，加快组织工程向临床应用转化需要新的思路与方法。
　　本研究在国际上首次采用不可降解的聚氨酯弹性体颗粒做为耳廓支架材料并以热熔融沉积（Fuseddepositionmodelling，FDM）快速成型技术精确成型人耳廓形态多孔支架，将凝胶与软骨细胞的混合物接种至支架上，通过体内外培养观察软骨的形成以及耳廓精细形态随时间变化情况。试图通过本研究解决上述耳廓修复重建方法中人工假体的暴露感染、自体肋软骨的二次伤害导致胸廓畸形以及组织工程耳廓软骨支架降解后外形不能保持的问题。本研究具体内容包括：
　　一、聚氨酯人耳廓支架快速成型
　　采用热熔融沉积制造快速成型技术，研究医用聚氨酯弹性颗粒材料成型耳廓软骨支架的工艺。通过分析各成型参数对于成型性能的影响，选择了最佳的支架成型参数。同时建立了不同网格划分模型，进行支架力学性能、孔径大小的测试与评价，明确网格划分和支架力学性能的关系，并制作出具有合适力学性能和孔径大小并且具有精细形态的多孔耳廓弹性支架。
　　二、生物学实验
　　采用消化法分离新西兰大白兔耳廓软骨细胞体外进行培养。细胞生长状态良好，且至少3代以内软骨细胞表型稳定，生长曲线正常，番红“O”、甲苯胺蓝及Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。收集生长良好的第二代耳廓软骨细胞接种至聚氨酯支架上进行体外培养，倒置显微镜及扫描电镜观察细胞在材料表面增殖黏附情况。软骨细胞聚氨酯支架复合体体外培养7天后移植到裸鼠和新西兰大白兔背部皮下。裸鼠体内移植4、8、12周，兔体内移植4、8周后取材并观察复合体形成软骨能力以及耳廓形态变化。取出的复合体进行大体观察后做硬组织切片以组织学方法检测鉴定。
　　本研究得到以下结果：
　　1.本研究在国际上首次采用聚氨酯弹性颗粒做为支架材料，调整支架的孔径大小使支架的弹性与正常耳廓相当，以FDM快速成型技术制作精细形态的人耳廓支架。支架纵向最大拉应力与天然耳软骨最大拉应力接近，而横向拉伸力超过天然耳软骨的两倍。细胞支架复合物体外培养表明聚氨酯支架具有良好的生物相容性，相差显微镜及扫描电镜显示细胞增殖黏附与支架上，分布比较均匀。体外培养8周后，乳白色半透明的膜状软骨包绕支架纤维并覆盖全部支架网孔，细胞分泌糖胺聚糖和Ⅱ型胶原。
　　2．复合体体内移植表明裸鼠体内移植可以形成较为成熟的软骨组织；同种异体新西兰大白兔体内移植在观察期内形成纤维化软骨，在观察期内移植的细胞/耳廓支架复合体能够保持精细形态。移植物取材得到的软骨支架复合组织外观呈半透明或黄白色，略带光泽，有很强的弹性。裸鼠体内软骨复合体切片染色显示有成熟的软骨组织并具有糖胺聚糖和Ⅱ型胶原分泌能力。兔体内软骨复合体切片染色显示多数长梭状细胞以及少数炎症细胞浸润，Ⅱ型胶原免疫组化染色阳性。
　　通过本研究结果，得出如下结论：快速成型多孔聚氨酯弹性耳廓支架复合软骨细胞可以形成成熟软骨，在较长观察期内保持了原始精细形态。多孔聚氨酯弹性耳廓支架复合软骨细胞构建精细形态组织工程耳廓软骨具有可能的临床应用前景。挑战依然存在，根据生物实验结果进一步优化各项参数和实验条件，使结构体形成比较连续一致大块的弹性软骨并长期保持精细形态是下一步的实验目标；使组织工程耳廓走向临床应用是本研究的最终目标。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

一、小耳畸形和外耳缺损的修复方法

二、组织工程耳廓软骨研究现状

三、快速成型在耳廓支架制作中的应用

正文

第一部分 聚氨酯人耳廓支架快速成型及测试

第二部分 生物学实验

全 文 总 结

参考文献

附 图

个人简历和研究成果

致谢