CFTR氯通道激动剂对肺泡上皮细胞氧化损伤的保护作用

摘要

急性肺损伤(acute lung injury，ALI)是由心源性以外的各种肺内外致病因素所导致的急性、进行性缺氧性呼吸衰竭。其主要病理特征为通透性肺水肿及透明膜形成，并伴有肺间质纤维化。越来越多的证据表明，活性氧(reactive oxygen species,ROS)和氧自由基(oxygen free radicals,OFR)与肺损伤有着十分密切的关系，氧化应激产生的大量H2O2作用于肺部，可引起肺泡上皮细胞(alveolar epithelial cell,AEC)活性降低，甚至产生ALI。文献报道肺泡上皮细胞Na+、Cl-异常跨膜转运在肺水肿形成中起重要作用。囊性纤维跨膜电导调节因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator,CFTR)是AEC上一种Cl-通道蛋白，CFTR异常可使Na+通道对Na+的转运功能降低，Cl-分泌减少，易导致肺组织水肿。4-Chloro-benzo[F]isoquinoline(CBIQ)是一种CFTRCl-通道特异性激动剂，它能促进CFTRCl-通道开放，使Na+内流增加，提高肺泡的液体清除能力。所以，CBIQ作用于氧化损伤细胞的CFTRCl-通道，可间接激活Na+通道，增加细胞钠水转运能力，达到保护受损细胞的作用。
　　目的：
　　本实验以活性氧为刺激因子，选择体外培养的AEC细胞系A549细胞为研究对象，建立氧化应激AEC损伤模型，观察CBIQ对AEC氧化损伤的保护作用及可能机制。探讨CFTRCl-通道及CBIQ在ALI发生发展中的作用。
　　方法：
　　1.细胞活力检测应用MTT法，检测不同浓度CBIQ对正常及H2O2损伤的肺泡上皮细胞株A549的保护作用。正常细胞株分2组，即对照组：只加培养液；实验组：分别加入不同浓度的CBIQ(浓度分别为1?10-1、1?10-2、1?10-3、1?10-4和1?10-5mmol/L)。损伤细胞株分3组：即对照组：只加培养液；损伤组：加入100μmol/LH2O2；实验组：加入100μmol/LH2O2后再分别加入不同浓度的CBIQ(浓度分别为1?10-2、1?10-3、1?10-4和1?10-5mmol/L)。
　　2.DNA-ladder检测细胞凋亡，观察各组细胞DNA损伤片段的变化，分析H2O2对AEC损伤的程度及CBIQ的保护作用；相差显微镜观察Hoechst染色后各组细胞凋亡形态的变化。实验共分3组：即对照组；H2O2损伤组；H2O2+CBIQ实验组。
　　3.全细胞膜片钳法观察H2O2损伤前后及加入CBIQ、氯通道阻断剂(DPC)或钙通道阻断剂尼卡地平(nicadipine)后，肺泡上皮细胞CFTRCl-通道电流的变化。探讨CFTRCl-通道激动剂对AEC保护作用的机制及与Ca2+之间的关系。
　　结果：
　　1.H2O2损伤后的A549细胞死亡数较正常组明显增加；损伤后的细胞经不同浓度CBIQ处理后，细胞死亡数明显减少，其中浓度为1?10-2和1?10-3mmol/L的CBIQ组细胞平均存活率分别为(76.1±0.8)％，(71.3±1.0)％，较损伤组(46.3±0.9)％明显增高(P<0.01，n=15)。
　　2.对照组DNA条带结构完整，电泳胶上无任何片段可见。损伤组则形成许多小的连续的DNA损伤片段。实验组经终浓度为100μmol/LH2O2及10μmol/LCBIQ共同干预4h后，可检测到凋亡标志性的DNA梯形带，降解片段亮度明显降低，条带明显减少，细胞凋亡率(28.5±3.9)％较损伤组(47.3±2.7)％明显下降(P<0.05，n=5)。
　　3.正常细胞及H2O2损伤后的细胞均记录到类似典型的CFTRCl-电流，均可被相对特异性的CFTRCl-通道阻断剂DPC所抑制。但损伤细胞的CFTRCl-电流较正常细胞明显减小。CBIQ对H2O2损伤后的CFTRCl-电流、被DPC和nicadipine阻断后的CFTRCl-电流均有激动作用。
　　结论：
　　1.H2O2诱导了肺泡上皮细胞氧化应激损伤的病理过程。
　　2.CFTRCl-通道激动剂CBIQ对于H2O2诱导的肺泡上皮细胞损伤具有保护作用。
　　3.CFTRCl-通道激动剂CBIQ可能部分通过对Ca2+的调节起到保护受损细胞的作用。

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缩略语表

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前 言

文献回顾

一、活性氧、氧化应激与急性肺损伤

二、肺泡上皮、肺水肿与急性肺损伤

三、氯通道、氯通道激动剂与急性肺损伤

正 文

实验一 氯通道激动剂对氧化损伤的肺泡上皮细胞活力的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 氯通道激动剂对氧化损伤的肺泡上皮细胞凋亡的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 氯通道激动剂对氧化损伤的肺泡上皮细胞 CFTR Cl-电流的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

附 录

个人简历和研究成果

致谢