HIF-1α在缺氧诱导的体外脉络膜新生血管生成中的调控作用

摘要

研究背景年龄相关性黄斑变性(age-relatedmaculardegeneration,AMD)是50岁以上人群引起视力损失的首要原因。渗出型AMD是以脉络膜新生血管形成（choroidalneovascularization,CNV）为特点，由脉络膜新生的血管在视网膜色素上皮层（retinalpigmentepithelium,RPE）和神经视网膜下生长的一种严重影响视力的疾病。由于出血或者瘢痕形成，CNV会引起急性或亚急性的视力丧失。尽管在形态学上已经对AMD继发的CNV进行了广泛地研究，但其具体病理机制仍然不甚明朗。
　　研究表明，黄斑部玻璃膜疣的堆积以及变性的色素上皮改变，会导致AMD黄斑部有限的血液供给和光感受器细胞之间高氧需求之间平衡的破坏，导致RPE层相对的缺氧，上调表达一些生长因子，如血管内皮细胞生长因子（vascularendothelialgrowthfactor,VEGF）等，从而促进了CNV的形成。因此认为，缺氧在CNV的发生发展中具有重要的作用，而VEGF则是一个主要病理因子。已有证据提示AMD患者其RPE细胞VEGF水平升高。而缺氧条件下培养的RPE细胞，其VEGF的mRNA和蛋白表达都显著升高。近来，Ephrin/Eph受体家族——和VEGF/VEGFR同为受体酪氨酸激酶（receptortyrosinekinase,RTK）家族，近来在血管发生中的作用也逐渐受到人们的重视。研究发现，EphrinB2/EphB4也参与了CNV的发生和发展。
　　目前对于AMD的药物治疗，大多数是基于VEGF或者VEGF受体，如玻璃体内注射pegaptanib(Macugen)、ranibizumab(Lucentis)，bevacizumab(avastin)以及全身应用的VEGF-trap。但这些抗VEGF的治疗方法都存在一个潜在的弊端，即它们的目标仅仅是多个重要血管发生因子中的一个。而其他的治疗，例如经瞳孔温热疗法（transpupillarythermotherapy,TTT）、光动力疗法（photodynamictherapy,PDT）或者玻璃体内注射曲安耐德（triamcinoloneacetonide,TA），虽然可以通过部分地下调多种血管发生因子的表达而发挥抑制CNV的作用，但又存在较显著的副作用。
　　近来，缺氧诱导因子1（hypoxia-induciblefactor1,HIF-1）逐渐被大家关注，被认为是治疗CNV的一个新靶点。HIF-1是一个异源二聚体，由组成表达的HIF-1β亚体以及氧调节的HIF-1α亚体构成。在缺氧条件下，稳定表达的HIF-1α能够诱导和血管发生、红细胞生成、糖代谢有关的多种基因表达，如VEGF、促红细胞生成素（erythropoietin，EPO）以及糖酵解酶。同时也有研究证明，在小鼠表皮皮瓣的缺氧模型上，缺氧不但可以上调HIF-1α和VEGF表达，而且也能够上调表皮上A和B类的Eph受体和Ephrin配体。在Hep3B细胞和PC-3细胞，通过针对HIF-1α的siRNA可以抑制缺氧诱导的Eph受体和Ephrin配体表达，证明HIF-1α也是缺氧条件下Ephrin/Eph受体表达的关键性因子。
　　因此我们设想，基因缄默RPE细胞的HIF-1α表达有可能抑制血管发生。本研究中，我们利用RNA干扰（RNAi）技术，在RPE细胞上基因缄默HIF-1α，并和牛脉络膜微血管内皮细胞（choroidalmicrovascularendothelialcells,CEC）细胞共培养，观察其对CEC增生以及管腔形成的影响，探讨HIF-1α对血管发生的抑制作用。
　　目的
　　1.利用免疫磁珠法原代分离培养牛CEC，并进行鉴定；
　　2.观察CEC上VEGFR2和EphrinB2/EphB4的表达以及缺氧对RPE细胞VEGF/VEGFR2以及EphrinB2/EphB4表达的影响；
　　3.构建和筛选针对HIF-1α基因的shRNA载体，转染RPE细胞后检测缺氧条件下VEGF和EphrinB2/EphB4的表达；
　　4.建立RPE/CEC共培养模型，并观察缺氧条件下RPE细胞对CEC增生、移行以及管腔形成的影响。
　　1.显微分离牛脉络膜微血管，采用1g?L-1胶原酶一步法消化，并采用免疫磁珠分选脉络膜微血管内皮细胞，使用内皮细胞培养基进行原代培养。利用光学和电子显微镜进行形态学观察，利用VonWillebrand因子免疫荧光染色及Dil-Ac-LDL吞噬实验进行细胞学鉴定，利用管腔形成实验观察内皮细胞形成管腔能力。
　　2.在细胞培养液中加入200μMCoCl2建立人RPE细胞缺氧模型，培养0、1、3、6、12和24h，利用免疫荧光染色观察RPE细胞及CEC上VEGFR2及EphrinB2/EphB4的表达，实时定量PCR以及Westernblot观察缺氧条件下RPE细胞VEGF/VEGFR2以及EphrinB2/EphB4的表达，利用Westernblot观察CEC上VEGFR2及EphrinB2/EphB4的表达，ELISA法观察RPE细胞上清中VEGF的含量；
　　3.构建3条针对人HIF-1α基因的shRNA，利用实时定量PCR筛选抑制效率最高的shRNA。基因敲除RPE细胞HIF-1α后，利用实时定量PCR和Westernblot观察缺氧条件下其对RPE细胞HIF-1α和VEGF以及EphrinB2/EphB4表达的影响，ELISA观察上清中VEGF的表达；
　　4.利用Transwell共培养小室建立RPE细胞和CEC的增生、移行以及管腔形成模型，观察基因敲除HIF-1α后RPE细胞对CEC增生、移行以及管腔形成的影响。
　　结果
　　1.采用本研究改良的方法可以获得纯度高达95％的脉络膜微血管内皮细胞，外观呈细长、纺锤样，融合后呈典型铺路石样外观。电子显微镜观察可见胞浆内靠近核膜外的Weibel-Palade小体（棒状小体），免疫荧光显示VonWillebrand因子表达阳性，Dil-Ac-LDL吞噬试验阳性；在凝胶中可以形成明显管腔结构；
　　2.（1）RPE细胞上除了存在VEGFR2表达，发现RPE细胞上存在EphB4和EphrinB2的表达；（2）化学缺氧能够以时间依赖性诱导HIF-1α在mRNA及蛋白水平的表达，在mRNA水平，HIF-1α在0h时也有表达，3h表达最高，随后逐渐降低，12h时恢复到基础水平；其蛋白0h时是没有表达的，3h时表达到达峰值；其相应的转录产物VEGF同样也显示出呈时间依赖性表达；其mRNA水平也是在3h时表达到达最大值，而蛋白水平则在12h表达最高；缺氧对VEGFR2的表达也有诱导作用，其mRNA表达在3h时达到峰值，而蛋白表达在6h时表达最高，随后逐渐降低；（3）化学缺氧可以刺激RPE细胞表达能够上调EphB4受体转录和翻译水平的表达，在转录水平，缺氧3h时，EphB4表达增加了1.3倍；其蛋白表达也相应在6h时表达达到峰值，而随后降低。在缺氧条件下，相应EphrinB2受体在转录以及翻译水平下调表达；（2）CEC上存在VEGFR2、EphrinB2配体和EphB4受体的表达；
　　3.（1）shRNA1、2、3的抑制效率分别为77％，62％和54％，选择shRNA1（pshHIF-1α）对RPE细胞进行基因干扰实验；（2）和pDNA转染对照组相比，3h时相应HIF-1α及VEGFmRNA及蛋白水平表达均下降，其中HIF-1αmRNA和转染对照组相比下降了72.6％，而VEGFmRNA下降了75.6％；（3）pshHIF-1α转染组细胞上清中VEGF表达量最低，和pDNA对照转染组相比降低了58％（P<0.01）；（4）3h时，RPE细胞上EphB4受体的表达在经过RNAi处理后，和转染对照组相比其mRNA表达降低了73.2％，而对EphrinB2配体的mRNA表达影响不大。相应在蛋白水平上，可见RNAi处理后，在缺氧3h时EphB4受体的表达上调受到了抑制，表达降低；
　　4.在共培养系统内，RPE细胞HIF-1α被基因敲除后，CEC的增生、移行以及管腔形成显著受到了抑制，和对照组转染组相比，第3、4及5天CEC的增生率分别下降了40.2％,36.6％和36.8％；在5h时移行下降了49.6％，48h时管腔形成降低了40.4％。
　　结论
　　1.成功分离并纯化了牛CEC，可在短期内快速简便地获得足够数量的内皮细胞；
　　2.RPE细胞存在VEGF/VEGFR2及EphrinB2/EphrB4系统的表达，缺氧条件下和HIF-1α的表达相关，提示EphirnB2/EphB4在CNV的发生中具有一定的作用；同时验证了CEC上VEGFR2的表达，是RPE细胞分泌VEGF的作用点；
　　3.筛选出效率最高的pshHIF-1α，证实其可有效地抑制HIF-1α表达，从而降低VEGF表达，并提示EphB4的表达和HIF-1α相关；
　　4.在体外对RPE细胞HIF-1α进行基因干扰可抑制血管发生，为治疗CNV性疾病提供了可能的治疗方向，其结果国内外未见报道。

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封面

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

文献回顾

1 脉络膜微血管内皮细胞的培养及相关研究

2 Ephrin 配体和 Eph 受体酪氨酸激酶家族在眼部血管发生中的作用

3 缺氧诱导因子 1 与缺氧信号转导机制

4 小干扰 RNA 介导的血管发生抑制

第一部分 牛脉络膜微血管内皮细胞的纯化和体外培养

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第二部分 VEGFR2 和 EphrinB2/EphB4 在 CEC 中的表达以及缺氧对 RPE 细胞 VEGF/VEGFR2 和EphrinB2/EphB4 表达的影响

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第三部分 针对 HIF-1α 基因 shRNA 载体的构建、筛选以及转染 RPE 细胞后缺氧条件下 VEGF 和EphrinB2/EphB4 表达的变化

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

第四部分 基因缄默 RPE 细胞 HIF-1α 对缺氧诱发的 CEC 增生、移行和管腔形成的影响

1 引言

2 材料和方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢