大鼠视神经夹伤后视网膜节细胞的非折叠蛋白反应

摘要

视神经疾病是以视网膜节细胞（retinal ganglion cell,RGC）渐进性死亡为主要特点的疾病，RGC一但死亡或损伤后不能有效再生，保护RGC、预防视神经损伤一直为眼科研究领域关注的重点。非折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR）是神经元受到损伤刺激后首先做出的反应，起到保护神经元或诱导神经元凋亡的作用。近来研究提示，UPR可能与视网膜神经细胞及其纤维渐进性死亡密切相关。本实验观察大鼠视神经夹伤后其RGC中的UPR，初步探讨UPR在视神经损伤中的作用与反应机制。
　　目的：
　　1．通过夹伤大鼠视神经，并行视觉电生理检查，建立可靠的实验模型。
　　2．研究大鼠视神经夹伤后RGC的非折叠蛋白相关因子（PERK，IRE-1，calnexin）、AMPA受体亚基GluR2及凋亡细胞的表达，并分析其相互关系。
　　方法：
　　实验一：建立大鼠视神经夹伤模型并行视觉电生理检查
　　1．建立大鼠视神经夹伤模型暴露成年雄性SD大鼠视神经，反向镊以垂直角度于球后2mm处钳夹视神经20s。
　　2．视觉电生理检查分别检测大鼠正常及视神经夹伤后4h，8h，12h，1d，3d，7d损伤眼F-VEP、ERG的峰潜时和波幅变化。
　　实验二：大鼠视神经夹伤后视网膜节细胞的非折叠蛋白反应
　　1．按随机数字方法将动物分为对照组(4只)、损伤组（夹伤后不同时间组即4h，8h，12h，1d，3d，7d，共6组，每组4只）。对照组不夹伤视神经。各损伤组大鼠按上述时间点制备视网膜切片以备如下检查。
　　2．免疫荧光组织化学检查切片经兔抗大鼠PERK、calnexin、IRE-1＋AMPA抗体染色，激光扫描共聚焦显微镜观察并采图。
　　3．神经节细胞计数每张切片取4～5个视野，在40倍视野下对视网膜中PERK或calnexin表达阳性的神经节细胞计数。
　　结果：
　　1．建立大鼠视神经夹伤模型后，当时术眼瞳孔散大，光反射明显减弱，眼底血管灌注正常。术后未见伤口感染及眼底缺血表现。
　　2．正常大鼠F-VEP峰潜时为70.19±2.14ms、波幅为22.72±1.97μV，视神经损伤后各时间点P100波峰潜时均较正常大鼠缩短，至12h时最短，对比正常差异显著，而后逐渐延长，7d时已长于正常水平；波幅在损伤后明显下降，各时间点均低于正常水平，4h、1d、3d、7d具有极显著差异。伤后峰潜时在最大反应b波8h、12h和1d，明适应ERG的b波各时间点，闪烁反应3d，相比正常明显延长，差异具有显著性。伤后波幅在最大反应b波4h、8h、12h明显降低，具有极显著性差异，振荡电位O2波在1d及7d时升高，具有显著性差异，明适应视网膜电图在3d时下降,具有显著性差异。
　　3．大鼠视神经夹伤后，激光扫描共聚焦显微镜观察RGC中PERK，calnexin表达明显增强。损伤后4h，表达阳性的RGC细胞数增加，至24h时达到峰值，与对照组比较具有显著性差异（PERK，15.00±0.36对2.00±0.64；calnexin，11.75±1.44对4.00±0.57，P<0.05）。损伤后8h，RGC的IRE-1及GluR2表达增强，其中GluR2在胞膜上表达明显增强；Fluoro-Jade C染色在72h时RGC出现表达，并与GluR2共同表达。
　　结论：
　　1．大鼠视神经夹伤模型设计简单，便于操作，可确切的造成视神经损伤。
　　2．大鼠视神经夹伤后的F-VEP波幅显著下降，而ERG各成分总体变化不大，说明达到建模目的。
　　3．在视神经夹伤后，与UPR相关的PERK、IRE-1因子及分子伴侣calnexin在RGC表达增强，伤后72h时RGC出现凋亡，提示UPR参与了RGC损伤后至24h的保护过程，其后则更易诱导RGC发生凋亡。这些发现文献中未见报告。

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缩略语表

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英文摘要

前言

文 献 回 顾

1 UPR 概述及相关疾病

2 RGC 生物学

3 视神经损伤的动物模型

正文

实验一 建立大鼠视神经夹伤模型及视觉电生理检查

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 大鼠视神经夹伤后视网膜节细胞的非折叠蛋白反应

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附图

个人简历和研究成果

致谢