热休克蛋白90抑制剂17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素增强热诱导骨肉瘤细胞杀伤的研究

摘要

肿瘤热疗是触发细胞死亡与保护机制的典型应激刺激，二者的相互作用决定了热疗细胞的命运：死亡或者幸存。热休克蛋白家族成员中的分子量为90kD的热休克蛋白(HSP90)是真核细胞中最丰富、最活跃的伴侣蛋白之一。它在细胞发生应激反应时（如热休克），可以和那些由于环境刺激而使自身构象发生改变的蛋白相互作用，保证蛋白进行适当的折叠并防止蛋白非特异性聚集，从而维持细胞的正常活性。HSP90还参与甾体激素受体、转录因子、信号途径和翻译起始阶段的激酶及一氧化氮合酶的成熟、胞内转运和活性调节。HSP90作为分子伴侣，其已确定的客户蛋白超过100个，许多客户蛋白是细胞增殖信号通路中的重要分子，与肿瘤密切相关。因而以它作为靶标的靶向治疗具有较大的研究价值。
　　17-丙烯胺-17-去甲氧格尔德霉素(17AAG)是一种苯醌安沙霉素抗生素格尔德霉素(GA)的衍生物，它能与HSP90结合，促使HSP90所伴随的对肿瘤细胞的增殖和存活起重要作用的蛋白发生降解，而具有显著的抗肿瘤活性。
　　骨肉瘤是儿童和青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤。20世纪70年代以前，主要治疗方法是截肢和关节离断，5年生存率<25％，随着外科技术和影像学的发展，新辅助化疗、放疗、免疫治疗、热疗等多种治疗手段的综合应用，骨肉瘤治愈率有了改进，5年生存率达到80％。但目前的治疗手段仍无法解决肿瘤病人的转移、复发和药物耐药等情况，因此，寻求新的抗癌靶点有望为骨肉瘤的治疗开辟一条新的途径。为了研究HSP90抑制剂17AAG对骨肉瘤细胞的生物学作用及其对骨肉瘤细胞热诱导杀伤效应的影响并探讨其可能涉及的作用机制，本文完成了下列研究工作:
　　1.17AAG对骨肉瘤SOSP-9607细胞的生物学作用
　　采用四唑盐比色实验(MTT)法观察到17AAG明显抑制骨肉瘤SOSP-9607细胞的生长，呈剂量、时间依赖性，半数抑制浓度(IC50)为3.548μM;进一步采用AnnexinV-FITC染色流式细胞术(FCM)、吖啶醇荧光染色等方法观察到17AAG诱导骨肉瘤SOSP-9607细胞凋亡，呈剂量依赖性。
　　2.17AAG对热诱导骨肉瘤SOSP-9607细胞杀伤效应的影响
　　采用盐比色实验观察到加热与17AAG对骨肉瘤SOSP-9607细胞作用间有协同作用，加热联合17AAG治疗组明显增强了单独加热对骨肉瘤SOSP-9607细胞的杀伤效应(P＜0.01)；干细胞集落形成实验也显示加热联合17AAG治疗组较单独加热对骨肉瘤SOSP-9607细胞的杀伤效应明显增强(P＜0.05)；AnnexinV-FITC染色流式细胞术结果显示热疗联合17AAG治疗组所致凋亡率（52.2％）大于单纯加热组（17.5％）；且用吖啶橙荧光染色法观察到加热联合17AAG治疗组出现明显骨肉瘤SOSP-9607细胞固缩，着色不均而且较深，细胞核浓缩、裂解等凋亡特征。
　　3.17AAG单独或联合加热对MAPK信号转导通路的影响
　　通过蛋白免疫印迹分析观察到单独加热组磷酸化AKT及磷酸化Raf-1的水平并没有改变甚至有轻微增加，而应用17AAG联合加热组磷酸化AKT及磷酸化Raf-1的水平显著降低。该结果提示17AAG可能通过阻止MAPK信号通路中Erk支路与PI3K-AKT通路的信号转导途径增强热诱导骨肉瘤SOSP-9607细胞的杀伤效应。
　　综上所述，本研究证实了17AAG能抑制骨肉瘤细胞生长，诱导骨肉瘤细胞发生凋亡，为17AAG应用于骨肉瘤化疗提供了实验依据。将HSP90分子伴侣复合物阻止剂17AAG应用于骨肉瘤SOSP-9607细胞热疗具有显著热疗增敏效应;其机制可能涉及阻止MAPK信号通路中Erk支路与PI3K-AKT支路的抗凋亡活性。该研究结果为探索肿瘤热疗增敏靶点提供了一种新的思路：HSP90分子伴侣复合物可能成为改变热疗效应的一个新的分子靶点。热诱导

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缩略语表

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前言

文献回顾

一 肿瘤热疗的生物学机制研究进展

二 热休克蛋白与热耐受关系的研究进展

三 热休克蛋白 90 及其抑制剂研究进展

正文

实验一 17AAG 对骨肉瘤 SOSP-9607 细胞的生物学行为

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

实验二 17AAG 增强热诱导骨肉瘤 SOSP-9607细胞杀伤的研究

1 材料

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢