细胞直接三维受控组装技术构建组织工程化软骨的实验研究

摘要

软骨组织缺损的修复重建一直是骨科、整形外科等亟需解决的难题，软骨组织工程的兴起为此难题的解决带来了可能。传统组织工程技术的基本原理是：将大量体外扩增的种子细胞接种在可降解的生物支架材料上进行体外培养或植入体内组织器官缺损部位。本实验研究基于快速制造技术（RM,RapidManufacturing）,将兔耳软骨细胞与水凝胶类基质材料（海藻酸钠，明胶）混合后直接通过三维受控组装技术实现了在体外构建微观上具有适合细胞生存微环境，宏观上具有预定义的尺寸和形状的类软骨组织结构，并成功植入裸鼠皮下生成了透明组织工程化软骨组织，并分别对体内、体外构建的（类）软骨组织进行了生物学评价。实验结果表明用此种构建方法构建的组织工程化软骨可解决传统的细胞复合支架法所难以解决的问题。本论文的主要研究内容包括以下三个部分：
　　1.海藻酸钠明胶共混基质材料的制备及生物学评价
　　目的：通过体外将海藻酸钠明胶共混基质材料与软骨细胞进行三维培养，检测该共混材料体系能否保持细胞的正常状态。方法：Ⅱ型胶原酶消化法从兔耳获取软骨细胞，配制海藻酸钠明胶材料组S20G0，S10G10，S5G15、S3G17，S1G19，将各组材料与软骨细胞混合后制作藻酸钙明胶微球，常规体外培养，定期观察并做生物学检测、MTT检测、绘制增殖曲线。结果：细胞在微球内呈现正常的圆形生长状态，并能观察到正在分裂的细胞。HE,甲苯胺兰染色呈阳性结果。MTT曲线趋势明显。结论：软骨细胞在用氯化钙交联后的海藻酸钠和明胶的共混体系中生长良好，选定S3G17为软骨细胞受控组装的基质材料。
　　2.细胞直接三维受控组装技术体外构建组织工程化软骨
　　目的：结合组织工程和生物制造(BM,Bio-manufacturing)工程原理，研究应用快速成形（RP,RapidPrototyping）技术中的细胞—材料直接三维受控组装技术体外构建组织工程化软骨的可行性。方法：提取兔耳软骨细胞与海藻酸钠和明胶均匀混合，调整细胞浓度为3.0×107/ml。细胞基质材料混合物用细胞三维受控组装机Ⅰ代（清华大学机械系激光快速成形中心研制）按照预先设定的参数构建10mm×10mm×5mm大小的软骨组织前体，分别在体外培养1周，2周，3周，4周后对标本进行大体观察，定期行MTT检测，做冰冻切片进行组织学检测。结果：软骨细胞在结构体内增殖显著，保持正常的细胞形态和活力，组织学检测表明有大量软骨基质形成。结论:细胞直接三维受控组装技术为构建组织工程化软骨提供了一种可行的新途径。
　　3.细胞直接三维受控组装技术体内构建组织工程化软骨
　　目的：本实验选择裸鼠作为动物模型，将用细胞直接三维受控组装技术构建的软骨组织前体植入裸鼠背部，进一步在动物体内构建组织工程化软骨。方法：提取兔耳软骨细胞与海藻酸钠和明胶均匀混合，调整细胞浓度为4.0×107/ml。细胞基质材料混合物用细胞三维受控组装机Ⅰ代（清华大学机械系激光快速成形中心研制）按照预先设定的参数构建7mm×7mm×4mm大小的软骨组织前体6个，分别植入裸鼠一侧的背部皮下，对照组为同样大小、形状的非组装块，同样方法植入裸鼠对侧皮下。术后8周时取材，对其做大体观察并做石蜡切片，进行组织学、组织化学、免疫组织化学检测。结果：术后8周实验组形成的组织工程软骨与正常软骨组织颜色、质地相当，形状保持良好。结论：细胞直接三维受控组装技术构建的软骨组织前体可在体内8周成功生成特定形态的透明软骨组织，是一种很具潜力的构建组织工程软骨的新方法。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1．组织工程的概念及发展概况

2． 软骨组织工程研究现状

3. 组织工程软骨研究内容

4 生物制造工程技术的发展

5 细胞直接受控组装技术研究现状

正文

实验一 海藻酸钠明胶共混基质材料的制备及生物学评价

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 细胞直接三维受控组装技术体外构建组织工程化软骨

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 细胞直接三维受控组装技术体内构建组织工程化软骨

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢