大豆胚珠特异性启动子的克隆及其表达分析

摘要

AGL1基因属于MADS-box基因家族，MADS-box基因家族在植物花发育等许多方面起着重要的作用。因此，对于大豆来说，克隆大豆胚珠特异性表达的启动子AGL1对研究大豆花发育的分子调控机制及分子育种具有重要的理论和实际意义。
　　 本文以“小黄豆”品种为材料，通过拟南芥CDS确定大豆的CDS，然后根据查找到的AGL1启动子和内含子序列设计引物，进行PCR扩增。将获得的特异性序列连接到T载体，并进行酶切鉴定，将鉴定得到的反向连接的启动子序列和正向、反向连接的内含子序列进行测序。测序结果显示，通过TA克隆法从大豆中克隆了约1568bp的大豆胚珠特异性表达的AGL1启动子和3968bp的AGL1内含子与网上公布的序列同源性是99％，说明所克隆的序列克隆成功。
　　 将通过TA克隆的反向AGL1启动子序列用EcoR(I)和Pst(I)进行双酶切，同时对pCAMBIA1391Z载体也进行EcoR(I)和Pst(I)双酶切，然后把双酶切后的反向AGL1启动子序列和双酶切后的pCAMBIA1391Z载体进行连接，命名为pBIA1391ZAGL1P。将反向AGL1内含子序列和经EcoR(I)和Nco(I)双酶切后的pBIA1391ZAGL1P进行连接，命名为pBIA1391ZAGL1PI。另外，内含子对启动子可能有调控作用，将通过TA克隆获得的正反向内含子序列和-49+pBIA1391Z载体进行EcoR(I)和Nco(I)双酶切后连接，并命名为pBI1391Z+（-49）-AGLI（正义连接）和pBI1391Z+(-49)-AGLI（反义连接）。经酶切鉴定，上述植物表达载体均构建正确。
　　 表达载体构建成功后，通过冻融法将植物表达载体pBIA1391ZAGL1P，pBIA1391ZAGL1PI转入农杆菌EHA105中。通过叶盘法将含有pBIA1391ZAGL1P和pBIA1391ZAGL1PI载体的农杆菌EHA105侵染烟草无菌苗叶片，并且经潮霉素筛选，获得再生的抗性植株35棵，并对抗性植株进行PCR分析，获得转基因植株35棵。对大豆根、茎、叶及花的不同时期不同部位进行RT-PCR，分析得出大豆根、茎、叶没有表达。通过对抗性植株GUS染色进行表达分析，其中35棵抗性植株中有3棵被染色。

目录

摘要

中英文缩略表

1．文献综述

1．1 MADS-box的研究进展

1．1．1 MADS-box基因家族的结构特征

1．1．2 MADS-box基因家族涉及的功能

1．1．3 MADS-box基因家族与种子的发育过程

1．1．4 MADS-box调控果实成熟

1．1．5 MADS-box基因家族在胚珠发育中的作用

1．1．6 大豆MADS-box基因的研究进展

1．2 植物转基因工程

1．2．1 植物转基因方法

1．3 顺式作用元件的概述

1．3．1 启动子、增强子及沉默子

1．4 转基因植株的筛选与检测

1．4．1 转基因植株的筛选

1．4．2 转基因植株的检测

1．5 本实验研究的目的和意义

2 AGL1启动子与内含子及表达载体相关序列克隆

2．1 试验材料

2．1．1 菌株与载体

2．1．2 材料

2．1．3 酶及试剂

2．1．4 仪器耗材

2．2 试验方法

2．2．1 大豆胚珠特异性验证

2．2．2 目的基因的PCR扩增

2．2．3 各个基因的TA克隆

2．2．4 重组质粒的提取与鉴定

2．2．5 重组质粒测序结果

2．3 结果与分析

2．3．1 目的AGL1启动子和内含子片段PCR扩增结果

2．3．2 大豆花不同器官的RT-PCR及序列分析

2．3．3 对扩增的大豆AGL1启动子和AGL1内含子序列进行测序、比对及其氨基酸结构分析

2．3．4 重组质粒双酶切鉴定

2．3．5 正、反义载体筛选

3 植物表达载体的构建

3．1 试验材料

3．1．1 菌株与载体

3．1．2 酶和试剂

3．1．3 仪器耗材

3．2 试验方法

3．2．1 植物表达载体pBI1391Z-AGL1P的构建

3．2．2 植物表达载体pBI1391Z-AGL1PI的构建

3．2．3 植物表达载体-49+pBI1391Z-AGL1I(正反义)的构建

3．2．4．植物表达载体pBI1391ZAGL1P与pBI1391ZAGL1PI转入到农杆菌

3．3 结果与分析

3．3．1 表达载体pBI1391ZAGL1P的构建

3．3．2 表达载体pBI1391ZAGL1PI的构建

3．3．3 表达载体-49+pBI1391Z-AGL1I(正反义)的构建

4 农杆菌介导的烟草遗传转化及转基因植株分析

4．1 试验材料

4．1．1 供试烟草品种

4．1．2 菌株和载体

4．1．3 培养基

4．1．4 主要生化试剂及其配制

4．2 试验方法

4．2．1 农杆菌的活化及菌液制备

4．2．2 烟草叶片总DNA提取

4．2．3 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化

4．2．4 GUS染色

4．2．5 转基因植株PCR扩增

4．3 结果与分析

4．3．1 AGL1启动子和AGL1启动子内含子转化植株的筛选与分子检测

5 讨论与展望

5．1 大豆胚珠特异性启动子AGL1启动子和AGL1内含子的获得

5．2 大豆胚珠特异性启动子表达分析

6 结论和后续工作

参考文献

致谢

声明