低分子量釉原蛋白的纯化及其对牙源性间充质来源细胞作用的实验研究

摘要

釉原蛋白（amelogenin,Am）是由成釉细胞分泌的一种最主要的釉基质蛋白，在釉质矿化和牙根发育过程中发挥重要作用。1999年Biora开发了Emdogain?（釉原蛋白的商品名）产品，经FDA批准Emdogain?可用作牙周骨内缺损与根面平整区域的治疗，随后在牙周病的治疗和牙周缺损的修复中得到极为广泛的应用。近年来研究发现，Emdogain?也能够促进多种牙源性间充质细胞的增殖，提高鼠的骨髓间充质干细胞和牙龈成纤维细胞碱性磷酸酶活性并发现有明显的矿化结节形成；Emdogain?在牙周损伤修复中作用于微血管内皮细胞，能够促进牙周膜成纤维细胞和血管内皮细胞双向交互作用，从而促进牙周损伤的愈合；研究证实，Emdogain?作为牙髓切断术的盖髓剂具有促进修复性牙本质再生的作用；Emdogain?通过人血液中脂多糖和肽聚糖的诱导，还具有抑制致炎因子的释放，发挥一定的抗炎作用。
　　Emdogain?主要活性成分是从猪牙胚中提取的5.0kD低分子量釉原蛋白。近年来，国内对釉基质蛋白研究较多，但对釉原蛋白分离纯化和功能研究报道较少，所利用的方法均未得到纯度高、活性好的低分子量釉原蛋白。因此，本实验采用蛋白质液相色谱技术分离纯化了低分子量猪釉原蛋白（lowmolecularweightporcineamelogenin,LMWPA），通过蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分析其分子量，Edman降解方法进行N-末端氨基酸序列测序分析，观察它对人牙髓细胞(humandentalpulpcells,HDPCs)、人牙周膜细胞(humanperiodontalligamentcells,HPLCs)和大鼠牙乳头细胞（ratdentalpapillacells,RDPCs）增殖、碱性磷酸酶活性(alkalinephosphatase,ALP)以及矿化能力的影响，为该蛋白的自主研发以及进一步临床应用研究提供经验。完成的实验主要包括：
　　1、低分子量釉原蛋白纯化、分子量测定及N-末端氨基酸序列测序
　　取六月龄猪上下颌骨第二磨牙牙胚，在冰上刮取干酪样的牙釉质并将其研磨成粉，用QSepharoseFastFlowcolumn离子交换层析柱进行纯化，收集洗脱组分并超滤浓缩,将浓缩后的样品再用SephacrylS-100HP凝胶过滤色谱柱进一步纯化，分别收集组分峰。用SDS-PAGE测定提取蛋白的分子量和纯度，将该蛋白组分进行蛋白质N-端氨基酸序列分析。电泳图显示为单一组分，分子量为5.0KD，蛋白送军事医学科学院采用Edman降解方法进行N-末端氨基酸序列测序分析，该蛋白N-末端10个氨基酸残基是Met、Pro、Leu、Pro、Pro、His、Pro、Gly、His和Pro,为釉原蛋白。
　　2、低分子量釉原蛋白电镜观察
　　透射电镜观察100μg/mlLMWPA，可见用以上蛋白质液相色谱方法从形成中的细胞外基质中分离的釉原蛋白片段比较均一，能够检测到直径为50-100nm的不规则球体样结构。扫描电镜观察1000μg/mlLMWPA，可见纤细的成组组成的棒条状结构，该结构沿着晶体的长轴呈树枝样伸展，伸展的同时稍有螺旋，蛋白的直径约为100nm。
　　3、低分子量釉原蛋白的生物学活性
　　通过MTT实验测定体外培养的HDPCs、HPLCs及RDPCs对不同浓度釉原蛋白的反应，鉴定所纯化蛋白的生物学活性。结果显示，作用于人牙髓细胞和牙周膜细胞，50μg/ml和100μg/ml时,能显著促进HDPCs和HPLCs的增殖。作用于RDPCs，25、50、100μg/ml组在前3天，随着时间的延长能够促进细胞的增殖，与对照组有显著性差异（P<0.05）。本实验表明所纯化的釉原蛋白在一定浓度条件下具有较好的生物学活性。
　　4、低分子量釉原蛋白对牙源性间充质细胞ALP活性的影响
　　通过ALP实验测定不同浓度的蛋白对体外培养的HDPCs、HPLCs及RDPCs的矿化能力和成骨细胞分化的影响。25μg/ml釉原蛋白作用于HDPCs、HPLCs，实验前5天与对照组有显著差异（P<0.01），能上调ALP活性，第5天开始作用减弱，与对照组无显著性差异（P>0.05）。50μg/ml和100μg/ml的釉原蛋白能上调ALP活性,实验第1天开始上调作用明显，至第5天达到最高峰，随后作用减弱，≥150μg/ml的釉原蛋白则下调ALP活性。对于RDPCs在实验的第3至5天50μg/ml和100μg/ml组细胞ALP活性明显上调，与对照组有显著性差异(P<0.05)，但是，在5天以后50μg/ml和100μg/mlLMWPA上调ALP活性的趋势有所下降，其余各组与对照组相比无统计学意义(P>0.05)。结果表明所纯化的釉原蛋白在一定浓度条件下具有较好的促进细胞矿化能力。
　　5、Von-kossa染色法检测低分子量釉原蛋白对RDPCs矿化能力的作用
　　本实验观察含50μg/ml釉原蛋白、2％胎牛血清的DMEM培养液作用于RDPCs后矿化结节的形成情况。结果表明，该浓度的釉原蛋白能够促使RDPCs形成矿化结节，这可能与釉原蛋白本身具有提高细胞ALP活性有关，还可能与该蛋白促进细胞增殖作用有关。
　　6、低分子量釉原蛋白PGA凝胶与新生大鼠牙乳头重组的体内研究
　　将含有50μg/ml釉原蛋白、6％PGA的凝胶与出生后4天大鼠第一磨牙牙乳头重组，生物蛋白胶包裹后移植到6周大鼠肾被膜下，2周后取材，HE染色，免疫组化观察移植物情况，对照组为不含釉原蛋白的6％PGA凝胶。2周后取材发现，实验组重组体为乳白色硬组织，HE染色可见有薄层的牙本质结构形成，内侧成牙本质细胞排列整齐。与对照组相比，免疫组化结果显示，实验组在成牙本质细胞处Ⅰ型胶原染色阳性。说明50μg/mlLMWPA与PGA复合的凝胶有诱导间充质发育并促进牙本质形成的作用。
　　通过上述实验表明，我们提取的釉原蛋白具有良好的生物学活性，在一定程度上可以促进牙源性间充质细胞增殖和矿化。

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声明

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中文摘要

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前言

文献回顾

釉原蛋白的特性

釉原蛋白对晶体形态的调控

釉原蛋白的体内应用研究

釉原蛋白的体外研究

釉原蛋白的分离纯化

正文

实验一 低分子量釉原蛋白的纯化和鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 低分子量釉原蛋白电子显微镜下形态

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 低分子量釉原蛋白生物活性测定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验四 低分子量釉原蛋白对细胞碱性磷酸酶活性的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验五 低分子量釉原蛋白对大鼠牙乳头细胞矿化诱导的研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验六 低分子量釉原蛋白与大鼠牙乳头相互诱导作用的体内研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

临 床 病 例

个人简历和研究成果

致谢