整合素连接激酶在高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞生物学行为变化中的作用

摘要

研究背景：
　　整合素连接激酶（integrin-linkedkinase，ILK）是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，通过与整合素β1、β3亚单位结合，介导细胞外基质和生长因子信号向胞内传递，为PI3-K的作用靶点之一，并调控PKB/AKT及GSK-3β活性，调节细胞的生长、存活、细胞周期、转分化、凋亡、侵袭、移行以及肿瘤血管的发生。与单纯的年龄相关性白内障相比，糖尿病性白内障的发病年龄提前，而且白内障术后后囊混浊的发生也较严重。研究显示，在晶状体纤维化类疾病，如后发性白内障(after-cataract;或后囊混浊，posteriorcapsuleopacification,PCO)和前极性白内障(anteriorsubcapsularcataract,ASC)形成过程中，整合素家族参与了晶状体上皮的增生、凋亡和晶状体上皮向间充质转化（epithelial-to-mesenchymaltransition,EMT），ILK作为整合素家族向胞内信号传递过程中的重要环节，在此信号转导过程中可能起关键作用。对糖尿病肾病的研究发现，肾小球足细胞及系膜细胞在高浓度葡萄糖刺激后ILK的表达升高，并且ILK介导了肾小管上皮细胞EMT，并促进肾纤维化疾病的发生。在糖尿病患者白内障和后性白内障的发生发展过程中，ILK是否参与晶状体上皮细胞（lensepithelialcells,LECs）的增生、凋亡和EMT等过程尚不清楚。
　　目的：
　　观察高浓度葡萄糖对体外培养人LECs增生、凋亡、死亡和EMT的影响，以及对ILK表达的影响；利用RNA干扰技术，探讨ILK对上述细胞行为变化的作用。
　　方法：
　　将体外培养的人LECs系SRA01/04细胞分别培养在含葡萄糖5.5mmol/L（正常对照组）和30.5mmol/L（高糖组）的培养液中，用间接免疫荧光染色、RT-PCR及流式细胞术检测对照组和高糖作用24h后细胞增生核抗原（PCNA）、晶状体上皮细胞（LECs）转化指标α-SMA和FN的表达情况；用PI和AnnexinⅤ双染，流式细胞术检测5.5mmol/L、30.5mmol/L、55.5mmol/L、80.5mmol/L、105.5mmol/L葡萄糖处理后24h，细胞早期凋亡和死亡百分比例；用间接免疫荧光染色观察高糖作用24h后ILK的表达、RT-PCR检测高浓度葡萄糖作用后0、6、24hILKmRNA的表达；利用ILKsiRNA脂质体转染细胞，转染6h后，细胞分别经过含5.5mmol/L和30.5mmol/L葡萄糖的培养液处理24h，分别检测ILK、PCNA、α-SMA和FN在mRNA水平表达的变化。
　　结果：
　　免疫荧光染色显示高浓度葡萄糖作用24h后，SRA01/04细胞ILK、PCNA、α-SMA和FN的荧光强度较对照组增强，在mRNA水平上，它们的表达分别是对照组的2.23、2.00、1.74和1.78倍（P=0.0002、0.00012、0.012、0.0095），流式细胞术检测高糖组表达PCNA，α-SMA的阳性细胞数比例均数分别为55.8％、59.7％，较对照组的比例升高（P=0.016、0.0006）；5.5mmol/L、30.5mmol/L、55.5mmol/L、80.5mmol/L、105.5mmol/L浓度葡萄糖处理后24h，各组细胞的凋亡比例无明显变化（P=0.227,F=1.489)；细胞的死亡比例，30.5mmol/L、55.5mmol/L葡萄糖组与对照组（5.5mmol/L）比较无明显差异，80.5mmol/L、105.5mmol/L葡萄糖组较对照组（5.5mmol/L）死亡细胞比例上升（P<0.01,P<0.001），55.5mmol/L、80.5mmol/L、105.5mmol/L葡萄糖组死亡细胞比例有逐渐递增趋势。筛选出的ILKsiRNA的干涉效率达70％，在ILKsiRNA干扰后，正常组培养的细胞ILK的表达是非转染细胞的30％，高糖组细胞ILKmRNA是非转染细胞的21％（P<0.05），ILKsiRNA转染细胞的PCNA、α-SMA和FN的表达分别是非转染细胞的29％、33％和39％（P<0.05）。
　　结论：
　　高浓度葡萄糖诱导LECs的增生、使上皮向间质细胞转化增强；24h暴露对细胞凋亡没有明显影响；细胞的死亡随葡萄糖浓度的升高而递增。高浓度葡萄糖诱导ILK的表达增高，通过小干扰RNA，能有效抑制ILK的表达，抑制ILK的高表达能有效阻止高浓度葡萄糖刺激的细胞的增生和上皮向间质细胞的转化。

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前言

文献回顾

1 糖尿病性白内障概况

2 糖尿病性白内障的发病机制

3 晶状体上皮细胞凋亡、增殖和 EMT 在糖尿病性白内障和 PCO 中的作用

4 细胞外基质（ECM）及整合素与晶状体的发育和白内障的关系

5 整合素连接激酶（ILK）的研究进展

正文

实验一高浓度葡萄糖诱导体外培养的人晶状体上皮细胞的生物学行为变化

1 主要材料、试剂和仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二ILK 在高浓度葡萄糖诱导的人晶状体上皮细胞增殖和转分化中的作用

1 主要材料、试剂和仪器

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢