p21waf1/cip1在锰诱导的神经毒性中的作用及调控机制研究

摘要

锰是一种常见的环境和职业污染物，可通过呼吸道、消化道等多种途径进入人体蓄积并产生不良作用。因此，锰对人体的影响正日益受到重视。锰神经毒性的主要病变部位位于苍白球、尾状核、壳核和黑质，在临床上主要表现为锥体外系神经受损症状，这可能与锰选择性的蓄积部位有关。研究证明，脑代谢异常和多巴胺能神经元损伤可能是锰中毒导致震颤性麻痹的主要原因。尽管国内外已进行了一系列研究，但锰神经毒性的确切机制仍不清楚。
　　我们近来的研究发现，锰中毒除了可引起多巴胺能神经元损伤，还可使大鼠黑质纹状体和多巴胺能的PC12细胞p21表达明显升高。p21作为细胞周期蛋白依赖激酶抑制因子，是CIP家族的一员，它可直接与CDK1、CDK2、CDK4和cyclinA、B、D、E共同参与形成具有酶活性的复合物，发挥细胞周期调节功能。越来越多的研究证实，p21不仅仅是在细胞分裂中发挥功能，p21还可通过p53依赖或p53非依赖途径在细胞死亡中起到重要的调节作用。还有研究证实细胞生长异常以及细胞增殖调控机制与神经退行性变密切相关，细胞周期相关蛋白的表达可能参与了多种慢性神经变性疾病的发病机制。此外关于神经细胞的研究也证实了细胞周期蛋白在神经元凋亡中的作用。
　　目的：
　　通过建立锰中毒的动物和细胞模型，观察锰对p21表达的影响，并进一步通过体外实验探讨p21在锰诱导的神经毒性中的作用及表达调控机制，从而为进一步阐明锰的神经毒性作用提供新的思路和理论依据。
　　方法：
　　1．使用脑立体定位注射方法建立锰中毒的动物模型，采用免疫荧光染色、westernblot和RT-PCR检测多巴胺能神经元的损伤和p21表达的改变；
　　2．利用PC12细胞建立锰中毒的细胞模型，MTT、台盼蓝染色、流式细胞术等检测细胞毒性；
　　3．Westernblot、免疫荧光染色和siRNA转染等检测p21在锰诱导的细胞毒性中的作用；
　　4．Westernblot、RT-PCR、荧光素酶报告基因等方法检测锰对p21的表达调控机制。
　　结果：
　　1．锰对大鼠多巴胺能神经元损伤和p21表达的影响
　　通过脑立体定位注射方法建立大鼠锰中毒的动物模型；免疫荧光染色发现染锰后可造成大鼠黑质部位TH免疫反应阳性细胞数目明显减少，RT-PCR和westernblot结果证实在多巴胺能神经元损伤的同时，伴随着p21mRNA和蛋白水平明显升高。
　　2．p21在锰诱导的多巴胺能PC12细胞损伤中的作用
　　MTT和台盼蓝染色结果显示，染锰后可造成PC12细胞活力明显减弱，且呈现时间和剂量依赖的趋势；流式细胞仪结果显示，锰染毒后PC12细胞的增殖受到抑制，细胞周期发生阻滞；RT-PCR和westernblot结果发现锰可引起PC12细胞p21mRNA和蛋白水平升高，而对其它相关分子表达没有明显改变；免疫荧光染色发现染锰后p21有向核聚集的趋势；p21siRNA转染进一步证实了p21在锰诱导的细胞生长和增殖中的作用，说明p21蛋白转位和表达改变可能参与了锰诱导的细胞毒性过程。
　　3．锰诱导的PC12细胞p21蛋白表达的调控机制
　　通过CHX预处理，我们发现锰诱导p21表达主要通过转录水平调节；荧光素酶报告基因结果显示，锰可使p21启动子活性增强，从转录起始水平增加p21的转录；锰并不影响PC12细胞p21mRNA和蛋白水平的稳定性体内体外模型westernblot结果还发现，锰可使DNA损伤标记物p-H2AX和p53水平升高，但p21是否通过p53依赖方式被激活还有待进一步研究
　　结论：
　　本研究首先通过体内实验，发现锰可造成大鼠多巴胺能神经元损伤和p21表达增加；体外研究也证实锰对多巴胺能的PC12细胞具有明显的毒性作用，而p21在细胞中异常表达可能是锰对多巴胺能神经细胞产生毒性作用的重要机制之一；随后从转录和翻译后水平探讨锰对p21蛋白表达的调控机制，发现锰可通过激活p21启动子，从转录起始水平调控p21蛋白的表达，同时发现锰并不影响PC12细胞p21mRNA和蛋白的稳定性；此外，体内体外实验均证实，锰还可引起DNA损伤和p53蛋白表达增加，它们可能在锰诱导的p21表达上调中起到激活作用，但锰是否通过p53依赖的转录激活方式诱导p21表达增加，还有待于进一步的研究。
　　综上所述，我们的研究初步阐明了p21在锰诱导的神经毒性中的可能作用，并初步探讨了锰对p21蛋白表达的调控机制，结果将为进一步阐明锰神经毒性的分子机制以及探寻有效的医学防护措施提供新的思路和理论依据。

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文 献 回 顾

1 锰及其神经毒性

2 细胞周期调控蛋白p21waf1/cip1 研究进展

正文

实验一 锰对大鼠多巴胺能神经元损伤和p21 表达的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 p21 在锰诱导的多巴胺能PC12 细胞损伤中的作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 锰对p21 蛋白表达的调控机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历及研究成果

致谢