重组腺病毒Ad-HGF对人绒毛膜滋养层细胞抗HBV感染作用

摘要

目的:(1)体外培养JEGⅢ,确定Ad-HGF感染人绒毛滋养层细胞(JEGⅢ)的最佳感染强度,检测不同时间点细胞对HGF的表达水平,初步探讨肝细胞生长因子(HGF)对JEGⅢ的调节作用,为下一步实验奠定基础。(2)Ad-HGF以最佳感染强度转染JEGⅢ,建立乙型肝炎病毒(HBV)感染转染Ad-HGF的JEGⅢ细胞模型,从形态学及定量两方面探讨HGF对HBV感染JEGⅢ的作用,为HBV宫内感染的防治提供理论依据。
　　方法:第一部分体外培养JEGⅢ,以携带HGF基因的重组腺病毒(Ad-HGF)为实验组,携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒(Ad-GFP)为对照组,不同感染强度(MOI)(10,25,50,100,200,400,800,1600)转染绒毛膜癌细胞系JEGⅢ,通过MTT法(检测细胞损伤程度)筛选和确定最佳MOI(高转染效率且对细胞低损伤),作为下一步携带HGF基因的重组腺病毒(Ad-HGF)转染细胞的最优条件。以最佳的MOI转染JEGⅢ后0,24,48,72h后,收集细胞上清,用ELISA法检测HGF蛋白的表达水平。第二部分基于前期研究,于5％ CO2,37℃的培养箱中,用含5%血清浓度的培养液使细胞饥饿,培养JEGⅢ细胞至50%铺满时,Ad-HGF以最佳MOI(200pfu/cell)转染JEGⅢ,48h后再加入HBV阳性血清(兰州军区总医院检验科采自乙型肝炎志愿者,2×108HBV-DNA/L),使其终浓度为100DNA/细胞,共同孵育24h后,每隔12h,分别于感染HBV后24,36,48,60,72h收集上清及细胞,将细胞用PBS洗一遍,800 r/min离心10min,弃去上清,再加入200μlPBS,置于-70℃冰箱中冷冻30分钟,再放入37℃水浴中,反复冻融三次,1000 r/min离心10min,吸取上清,与所收集培养上清混匀,分别用HE、GIMSA染色及透射电镜观察细胞形态和结构变化,荧光定量PCR检测培养物中HBV-DNA。实验数据采用SPSS12.0软件进行统计分析。
　　结果:(1)以高转染效率且对细胞低损伤为标准,确定最佳MOI为200pfu/cell。(2)Ad-HGF转染JEGⅢ不同时间段后,ELISA法检测HGF表达水平的结果显示:Ad-HGF有效的导入了细胞,且HGF表达水平48h内有时间依赖性,72h开始下降。(3)HE染色显示Ⅱ组较Ⅰ组细胞有较明显染色质浓缩、边缘化,核膜裂解和凋亡小体等典型的凋亡形态。Ⅲ组较空白对照组无明显形态学改变。GIMSA染色与HE染色结果相近。(4)电镜显示:Ⅱ组较Ⅰ组细胞有较明显细胞内线粒体嵴模糊不清或消失,核周间隙增宽,线粒体扩张,核膜模糊等现象,且Ⅱ组胞质内可见球形HBsAg颗粒,呈圆球形;Ⅳ组、空白对照组可见胞膜完整清晰,核仁大而明显,细胞质内有丰富的脂滴、线粒体、高尔基器、糖原颗粒以及大量游离的核糖体,两细胞膜接近处可见明显的细胞连接,为桥粒连接。Ⅲ组较Ⅳ组无明显变化。(5)分别于24h、36h、48h、60h、72h收集培养上清及细胞内的病毒,在转染Ad-HGF的情况下,各时间点收集的标本中检测到的HBV-DNA量均低于未转染Ad-HGF的情况,有统计学意义(P<0.05),提示HGF对HBV感染滋养细胞有保护作用,而各时间点之间HBV-DNA量差异不显著。
　　结论:(1) HGF可有效导入JEGⅢ,并促进细胞的增殖。(2) HGF可有效抑制HBV感染滋养层细胞。

目录

缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

正文

第一部分 确定AD-HGF 转染JEGⅢ的最佳MOI 及最佳作用时间

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 HE、GIMSA 染色及透射电镜观察细胞、形态和结构变化，荧光定量PCR 检测培养物中HBV-DNA 含量

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢