成束蛋白Fascin-1在非小细胞肺癌迁移、侵袭和增殖中作用的研究

摘要

目的：肺癌是目前世界范围内发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。转移是肺癌病人死亡的主要原因。成束蛋白Fascin-1在多种肿瘤组织中异常的表达增高，并且同肿瘤的转移密切相关。但是，其在肺癌中的作用尚不明确。本课题旨在研究Fascin-1在非小细胞肺癌迁移、侵袭和增殖中的作用，为肺癌转移的防治提供新靶点，开辟新的途径。
　　方法：
　　（1）收集98例临床非小细胞肺癌（NSCLC）病人的癌组织标本、配对正常肺组织，以及临床病理信息。采用免疫组化的方法检测成束蛋白Fascin-1以及Ki-67在肺癌组织以及正常肺组织中的表达。分析肺癌组织与正常肺组织间Fascin-1表达的差异；按年龄、性别、病理类型、临床TNM分期、区域淋巴结转移情况以及增殖状态分别进行分组，分析Fascin-1的表达与上述临床病理特征的相关性。
　　（2）体外克隆Fascin-1基因，并构建pcDNA3.1(+)-fascin-1真核表达载体；采用脂质体转染法转染肺癌A549细胞系；通过筛选后建立稳定的Fascin-1过表达克隆（pcDNA3.1(+)-fascin-1-2，pcDNA3.1(+)-fascin-1-5）。分别采用扫描电镜以及激光共聚焦显微镜观察Fascin-1对A549肺癌细胞形态结果的影响。
　　（3）为了进一步研究Fascin-1对A549细胞迁移、侵袭和增殖的影响：①采用划痕实验以及Transwell迁移体外实验检测Fascin-1对A549细胞迁移能力的影响；②采用Matrigel侵袭实验体外检测Fascin-1对A549细胞侵袭能力的影响；③采用裸鼠肺转移实验体内检测Fascin-1对A549细胞转移能力的影响；④采用MTT实验以及流式细胞技术体外检测Fascin-1对A549细胞增殖能力的影响；⑤采用裸鼠皮下成瘤实验以及免疫组化的方法检测Fascin-1对A549细胞体内增殖能力的影响。
　　结果：
　　(1)免疫组化检测结果显示：Fascin-1在肺癌组织中主要定位与阳性细胞胞浆和胞膜上，呈局灶性或弥漫性表达，其表达率为83.67％（82/98）；在肺癌组织，毛细血管内皮细胞及树突状细胞中呈阳性表达，而支气管肺泡上皮细胞及肺大血管内皮细胞中呈阴性表达；Fascin-1表达在不同性别、年龄以及病理类型之间无明显统计学差异（P＞0.05），但是同TNM分期以及区域淋巴结转移密切相关（P＜0.05）。在TNM分期中，I期患者Fascin-1的表达率为50.00％（7/14），IIa/b期病人中的表达率为82.05％（32/39），IIIa/b期病人中的表达率为95.56％（43/45）。Fascin-1在N0病人中的表达率为68.97％（20/29），在N1的病人中的表达率为87.50％（35/40），在N2的病人中的表达率为93.10％（27/29）。以Ki-67阳性指数将病人分为低增殖组(Ki-67labellingindex≤10％)和高增殖组(Ki-67labellingindex>10％)，低增殖组中，Fascin-1表达的阳性率为85.71％（18/21），高增值组为83.12％（64/77），各组之间无明显统计学差异。实验结果提示：Fascin-1在非小细胞肺癌中的表达与性别、年龄、病理类型以及增殖状况无关，但是与临床TNM分期以及区域淋巴结转移密切相关。
　　(2)以Hela细胞mRNA为模板，克隆Fascin-1基因，将其插入pcDNA3.1(+)真核表达载体，构建pcDNA3.1(+)-fascin-1重组质粒。采用脂质体转染法将其转染肺癌A549细胞，通过筛选后，建立了一系列稳定表达Fascin-1的克隆。采用RT-PCR以及Westernblot检测显示：克隆A549-fascin-1-2和A549-fascin-1-5分别在mRNA及蛋白水平中等量及高表达Fascin-1。为了保证后续实验的严谨性以及可重复性，我们选择这两个克隆进行后续实验。采用扫面电镜观察Fascin-1过表达对细胞形态的影响，结果显示：A549-fascin-1-2及A549-fascin-1-5表面丝状伪足的数目明显增多，并且变细、变长。表明：在肺癌A549细胞中，Fascin-1能够促进细胞表面丝状伪足的形成。为了观察Fascin-1过表达对肺癌A549细胞F-actin的影响，我们采用FITC标记的鬼笔环肽标记A549细胞。采用激光共聚焦显微镜观察，结果显示：在A549-fascin-1-2和A549-fascin-1-5细胞中，细胞呈多角形，且细胞周围大量细长的包含F-actin的丝状突出形成。结果提示：Fascin-1在肺癌A549细胞中通过调节F-actin从而促进细胞丝状伪足的形成。
　　(3)分别采用划痕实验、Transwell迁移实验以及Matrigel侵袭实验体外检测Fascin-1对A549细胞迁移和侵袭能力的影响，结果显示：同A549和A549-control相比，A549-fascin-1-2和A549-fascin-1-5迁移和侵袭能力显示增强，各组之间具有显著的统计学差异(P＜0.05)。裸鼠肺转移实验显示：同A549-control对照组相比，A549-fascin-1-5能够在裸鼠肺部形成大量转移结节，两组之间具有明显同继续差异(P＜0.05)。表明：Fascin-1在体内、外均能够促进肺癌细胞的迁移和侵袭。体外采用MTT法检测不同细胞的生长曲线，采用流式细胞检测其S期细胞比例，结果各组之间均无明显统计学差异（P＞0.05）。进一步采用小鼠皮下成瘤实验体内检测Fascin-1对A549细胞增殖的影响。结果无论肿瘤细胞生长曲线还是Ki-67指数，各组之间依然没有明显统计学差异（P＞0.05）。
　　结论：
　　（1）Fascin-1在非小细胞肺癌中高表达；Fascin-1的表达同临床TNM分期以及区域淋巴结转移密切相关，而同年龄、性别、病理类型以及细胞增殖之间无明显相关性。
　　（2）成功克隆了Fascin-1基因，并构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-fascin-1。构建Fascin-1稳定过表达的肺癌A549细胞系。采用扫描电镜及激光共聚焦技术证实：Fascin-1能够促进肺癌细胞A549丝状伪足的形成。
　　（3）在肺癌A549细胞中过表达Fascin-1，能够在体内、外均促进肺癌细胞的迁移和侵袭，但是对于肺癌细胞的增殖无明显的影响。Fascin-1可能是专职促进肺癌转移的一个重要基因。
　　本研究系统地研究了成束蛋白Fascin-1在非小细胞肺癌中的表达以及在肺癌A549细胞迁移、侵袭和增殖中的作用，证明Fascin1能够通过促进丝状伪足形成从而促进肺癌细胞迁移和侵袭。为肺癌转移的防治提供了新的靶点，开辟了新的途径。

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缩略语表

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前 言

文献回顾

一、成束蛋白 Fascin-1 的结构与分布

二、成束蛋白 Fascin-1 功能的研究进展

三、成束蛋白 Fascin-1 调控机制的研究进展

四、成束蛋白 Fascin-1 在肺癌中的研究进展及尚未解决的问题

正 文

实验一 Fascin-1 在非小细胞肺癌中的表达

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 Fascin-1 促进肺癌 A549 细胞丝状伪足的形成

1 材料

2 方法

3 结果

4. 讨论

实验三 Fascin-1 在体内、外对 A549 细胞迁移、侵袭和增殖的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢