AGEs通过SDF-1/CXCR4轴信号通路对心肌微血管内皮细胞血管新生的影响及机制

摘要

实验背景及目的：
　　糖尿病（Diabetesmellitus，DM）是一种严重危害人类健康的常见慢性疾病。糖尿病是冠心病的等危症，研究表明，代谢紊乱触发糖尿病心肌病变,导致心肌细胞纤维化,凋亡增加,出现心律失常、进行性心功能不全的一种慢性并发症,是糖尿病患者的主要死亡原因之一，其心肌微血管病变的主要病理改变是侧枝循环形成减少、心肌微血管密度降低等血管新生障碍。
　　糖尿病血管病变与高血糖产生的多种代谢产物关系密切，糖基化终产物（Advancedglycationendproducts，AGEs）是还原糖与肽的游离氨基端、蛋白质通过不可逆的非酶促糖化反应作用生成的Amadori产物及Schif碱形成的不可逆聚合物，是引起糖尿病微血管病变的重要原因之一。
　　既往研究指出，AGEs可使视网膜内皮细胞、脐静脉内皮细胞等自分泌VEGF增加，并影响胞内信号转导在糖尿病血管并发症中发挥致病作用。研究证明，AGEs可促进微血管病变的发生和发展。
　　基质细胞衍生因子(stromalcell-derivedfactor-1α,SDF-1α)是CXC趋化因子(chemokine)家族中的一员，最早是从小鼠骨髓基质干细胞中分离得出。CXCR4是一种7次跨膜的G蛋白耦联受体，是目前所知SDF-1的唯一受体，SDF-1是CXCR4的唯一生理性配体，其特异性受体阻断剂为AMD3100。最新的研究表明,SDF-1/CXCR4与细胞增殖、迁移密切相关，并在血管生成中发挥着重要作用。
　　目前，对于糖尿病心肌病变的机制尚不明确，本实验通过不同浓度的AGEs作用于心肌微血管内皮细胞，测定SDF-1/CXCR4的表达改变以及对心肌微血管内皮细胞血管新生的影响，探讨其发病机制，为临床治疗提供理论依据。
　　实验方法：
　　第一部分CMECs的培养及AGEs的孵育
　　1、实验采用SD大鼠，无菌条件下取大鼠左心室游离壁以消化法培养大鼠心肌微血管内皮细胞，并根据其特殊的形态学、是否表达Ⅷ因子以及吞噬乙酰化低密度脂蛋白Ac-LDL进行鉴定。
　　2、采用非酶促反应将BSA与葡萄糖在恒温37℃，避光条件下孵育100d。并采用完全相同的条件单独培养BSA作为对照组。孵育成功后，采用荧光分光光度仪鉴定AGEs并计算其蛋白含量。
　　第二部分不同浓度AGEs作用通过SDF-1/CXCR4轴信号通路对CMECs的影响
　　采用体外培养2-3代的CMECs，分别加入浓度为100mg/L、200mg/L和400mg/L的AGEs作用48h，随机分组后实验组每组加入0.1mg/LAMD3100.分别用MTT法检测细胞增殖能力、Transwell小室检测迁移能力并观察管样结构形成能力的情况。
　　第三部分不同时间AGEs对CMECs的影响及SDF-1/CXCR4在其中的作用
　　取对数生长期单层融合的CMECs，随机分组后AGEs组加入200mg/LAGEs，实验组加入CXCR4阻断剂0.1mg/LAMD3100，分别作用24h、48h、72h和96h，分别用MTT法检测细胞增殖能力、Hochest染色检测细胞凋亡、观察管样结构形成能力的改变。用Westernblot方法检测细胞CXCR4蛋白表达水平。
　　实验结果：
　　1、经过鉴定，体外成功分离及培养CMECs。
　　2、成功在体外经非酶促反应制备AGEs，经鉴定AGEs含量为93.6kU/g，对照组含量为2.5kU/g。
　　3、与对照组相比，不同浓度AGEs作用下，各组细胞增殖、迁移和管样结构形成能力明显增强，（P<0.05）。阻断SDF-1/CXCR4通路后，增殖、迁移和管样结构形成能力明显减弱，差异有统计学意义（P<0.05）。
　　4与对照组相比，AGEs可增加细胞的凋亡率，短期作用的AGEs可增强细胞的增殖和管样结构形成能力（P<0.05），随着作用时间延长，晚期AGEs使CMECs细胞大面积脱落，管样结构崩解（P<0.05）。
　　结论：
　　1.在AGEs作用早期，通过SDF-1/CXCR4通路促进细胞的增殖、迁移和管样结构的形成，并且呈浓度依赖性；
　　2.在AGEs作用后期，通过抑制CXCR4的表达，使细胞增殖、管样结构形成能力减弱，并增加细胞凋亡率。

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前 言

文献回顾

一 心肌微血管内皮细胞

二 糖尿病血管并发症与糖基化终产物

三 血管新生

四 细胞凋亡

五 SDF-1/CXCR4 轴信号系统

正 文

实验一 CMECs 的培养及 AGEs 的孵育

1 材料

2 方法

3 结果

4 .讨论

实验二： 不同浓度 AGEs作用通过 sdf-1/cxcr4通路对 CMECs的影响

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三：阻断 SDF-1/CXCR4 轴信号通路对 CME Cs 的影响及机制探讨

1．材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

附 图

个人简历和研究成果

致谢