光化学技术在大鼠坐骨神经损伤组织工程修复中的应用研究

摘要

周围神经损伤是很常见的疾病，按照有无缺损分为无缺损和有缺损两类，前者可以通过采用外膜法或束膜法直接断端缝合。而对于有缺损的周围神经损伤，短节段缺损可以采取包括延长或游离两侧损伤神经断端或是屈曲关节等方法缩短神经缺损，再采用外膜法或束膜法直接断端缝合。而对于长节段的神经缺损，临床上无法进行无张力缝合，目前主要采用自体神经移植或是采用组织工程神经导管桥接修复。但是，无论是无缺损或是小段缺损采取直接缝合，还是大段神经缺损采取自体神经移植或是人工神经导管桥接修复，神经的功能都无法完全恢复，国内外报道周围神经损伤修复的效果在60-85％之间。
　　神经组织损伤后,局部多种细胞、炎症介质会参与其中并直接影响到最终修复的效果。以往的实验研究将注意力集中在如何促进神经再生能力上，反而忽略了有关如何减少神经再生抑制因素的研究。神经损伤修复过程中最常见的抑制因素就是神经吻合口胶原纤维增生导致的瘢痕形成。虽然瘢痕形成对于正常的创伤修复是非常重要的一个环节，但是，神经吻合口的瘢痕一旦形成，瘢痕就如物理性屏障一样，会在神经纤维的再生迁移过程中阻碍再生轴突的延伸，并且瘢痕的形成会导致神经外膜与周围肌肉筋膜组织形成粘连，影响神经组织的正常滑动，与周围组织粘连后产生的机械性卡压则会压迫神经的血运，从而影响神经功能的恢复。
　　近年来实验研究发现无论显微外科技术多么精细，术后均会形成不同程度的吻合口瘢痕，并且术后的功能恢复也不尽如人意。而随着对神经再生室认识和对其组成结构和功能的研究深入，发现通过对神经再生外环境的干预，避免神经修复过程中瘢痕的大量形成，也是促进神经再生非常有效地途径。最近研究表明，光化学反应组织黏合技术，以激光激活化学物质的光生物化学反应为基础，诱导化学物质与组织间的电子转移，最终使组织伤口内的胶原分子通过共价键交联方式实现组织黏合。由于具有无缝合的特性，避免了由缝合针和缝线所致的再次损伤和缝线反应等不良作用。因此，如果能够采用光化学技术减少神经吻合口处瘢痕组织的形成，将能够有效地减少瘢痕组织对再生轴突的阻挡作用，从而有可能更好的促进神经功能的恢复。
　　本实验中，选用神经基底膜基质材料-胶原蛋白和壳聚糖为支架的主要原料，应用冷冻干燥技术，制备具有轴向平行排列微管结构的神经支架材料并用此支架材料桥接修复大鼠10mm坐骨神经缺损。同时，为了减少神经损伤修复部位瘢痕组织增生，我们采用光化学技术并结合人羊膜套管包绕支架材料封闭两侧吻合口，最后，应用免疫组织学、透射电镜、逆行示踪技术、神经电生理以及评测坐骨神经指数等方法，从形态学和功能学两方面综合评价光化学技术结合神经支架材料修复大鼠坐骨神经10mm缺损的疗效。
　　第一部分胶原-壳聚糖神经支架材料的制备及相关性能检测
　　目的：制备高度仿真的人工神经支架材料并检测其相关性能。
　　方法：以细胞外基质主要成分-胶原蛋白为原料，应用冷冻干燥技术制备仿真支架，扫描电镜观察其结构，评测支架孔径、孔隙率、吸水膨胀率、降解率及力学性能等。
　　结果：本实验制备的神经支架材料在组成及内部结构方面高度仿真正常神经基底膜，由于具有轴向微管排列的三维结构，且微管直径在27μm-68μm之间(此范围内的微管直径符合理想的支架材料对微孔直径的要求：小到能够对再生轴突起到物理性制约的作用，而且还可以有效引导其定向生长；大到能够允许再生支持细胞的渗入，并且可以为血管化提供足够的空间)，使其不仅在组成成份上，更在结构上高度仿生神经。这种轴向平行排列的微管结构，更有利于引导再生轴突定向生长，同时结果显示经过京尼平交联后具有较强的机械性能和良好的降解性能。
　　第二部分人羊膜对大鼠坐骨神经修复后局部瘢痕形成的作用研究
　　目的：探讨坐骨神经损伤后，人羊膜神经套管对神经吻合口瘢痕形成的预防作用及坐骨神经功能恢复的影响。
　　方法：按照Petersen分级标准对肌肉、筋膜和神经组织与周围组织粘连的程度进行评估，并应用免疫组织学(天狼星红染色)检测神经吻合口处胶原纤维含量。同时应用透射电镜、逆行示踪、神经电生理以及坐骨神经功能指数等方法，从形态学和功能学两方面评估人羊膜神经套管在修复大鼠坐骨神经10mm缺损的修复效果。
　　结果：虽然应用人羊膜神经套管和对照组没有明显差别。但是从形态学结果来看，应用人羊膜神经套管能够明显减少神经与周围组织粘连并减少吻合口内瘢痕形成。这样有利于保持神经的活动性，同时防止由于神经与周围组织粘连导致的神经牵拉损伤和神经营养血管受压。
　　第三部分光化学技术在大鼠坐骨神经缺损组织工程修复中的应用研究
　　目的：评价光化学技术修复大鼠坐骨神经缺损的有效性。
　　方法：应用光化学技术结合人羊膜神经套管包裹10mm自体神经桥接体和10mm人工神经支架材料，术后12周，按照Petersen分级标准对神经组织与周围肌肉筋膜组织粘连的程度进行评估，同时应用透射电镜、逆行示踪、电生理以及坐骨神经功能指数等方法，从形态学和功能学两方面评估光化学技术在组织工程修复大鼠坐骨神经缺损的疗效。
　　结果：应用光化学技术结合人羊膜神经套管不论在支架材料组还是在自体移植组都能够明显减少神经与周围组织粘连并减少吻合口内瘢痕形成。形态学观察结果显示：术后12周，大量的再生神经纤维通过支架长入远端。透射电镜结果显示：光化学组桥接段远端神经纤维直径和髓鞘厚度明显优于缝合组(p>0.05)。功能学检测结果显示：光化学组的运动神经传导速度、潜伏期和波幅明显优于缝合组(p>0.05)；逆行示踪标记后，在光化学组脊髓前角和背根神经节可检测到的荧光金标记阳性神经元明显多于缝合组；坐骨神经指数结果也同样证实。

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缩略语表

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前言

文 献 回 顾

一、周围神经的结构及特点

二、周围神经损伤的病理生理过程

三、周围神经损伤修复研究进展

四、有关减少神经损伤修复后瘢痕形成的研究现状

五、光化学反应组织黏合技术

六、展望

正文

第一部分：胶原-壳聚糖神经支架材料的制备及相关性能检测

1 材料和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第二部分：人羊膜对大鼠坐骨神经修复后局部 瘢痕形成的作用研究

1 材料和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

第三部分：光化学技术在大鼠坐骨神经缺损组织工程修复中的应用研究

1 材料和仪器

2 实验方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢