布莱凯特黑牛CoQ10合成相关酶COQ2基因cDNA克隆及其多态性分析

摘要

COQ2基因是真核生物中对羟基苯甲酸聚异戊二烯转移酶(PPT)的编码基因，该酶是CoQ10生物合成过程的主要限速酶，影响着体内CoQ10的合成和机体表型性状。根据已公布的普通牛COQ2基因序列和cDNA序列，对COQ2基因的7个外显子区域设计引物，PCR产物克隆测序后，比对、拼接得到布莱凯特黑牛COQ2基因的cDNA序列;并采用PCR-SSCP分析与克隆测序相结合的方法对COQ2基因外显子1、3和6进行多态性研究。结果表明: 1、布莱凯特黑牛COQ2基因cDNA序列，总长1546bp，由7个长分别为298b p、167b p、122bp、86bp、134bp、189bp和550bp的外显子组成，第46bp至第1161bp间为其氨基酸编码序列。与普通牛相比，其氨基酸序列第324位由N突变为H。 2、其外显子1存在三种基因型，其中AB基因型为优势基因型， A等位基因和B等位基因频率相差不大，其PIC值属中度多态。该多态位点为存在于外显子1第55bp处G→T的突变，使编码的氨基酸由A突变为S，进而使突变后蛋白质二级结构减少了1个α-螺旋和1个β-折叠，增加了1个β-转角。 3、其外显子3中也存在一个多态位点，为第102bp处A→T的突变，属同义突变。该突变也产生了三种基因型，其中CD基因型为优势基因型;D等位基因为优势等位基因;该多态位点PIC值也属中度多态。 4、其外显子6仅呈现一种基因型，该片段无多态性。 5、外显子1多态性与布莱凯特黑牛的背膘厚有一定的相关性，而与其眼肌面积无关，且两相关性分析均呈现出AB和BB基因型个体平均值较高。 本研究成功克隆、拼接了布菜凯特黑牛COQ2基因cDNA序列;在外显子1和3各发现1个多态位点，并对外显子1与布莱凯特黑牛的眼肌面积和背膘厚进行了相关性分析，这为研究COQ2基因多态性与CoQ10体内合成情况及其他性状相关性奠定了理论数据支撑，为布莱凯特黑牛新品种培育提供了主效基因筛选的理论数据。

目录

声明

摘要

文献综述

1 前言

2 CoQ10概述

2．1 CoQ10的化学性质

2．2 CoQ10的生物合成途径

2．3 CoQ10的作用

2．4 CoQ10研究现状

3 PPT及其编码基因UbiA／COQ2

3．1 PPT的特性

3．2 UbiA／COQ2基因及其研究进展

4 PCR-SSCP

4．1 PCR-SSCP的发展

4．2 PCR-SSCP的原理

4．3 PCR-SSCP分析的优缺点

5 研究的目的与意义

第一部分 布莱凯特黑牛COQ2基因cDNA克隆及序列分析

1 试验材料

1．1 试验样本

1．2 主要药品

1．3 试剂配制

1．4 主要仪器设备

2 试验方法

2．1 基因组DNA的提取

2．2 基因组DNA琼脂糖凝胶电泳

2．3 PCR扩增引物设计

2．4 PCR扩增及特异性检测

2．5 转化与重组质粒鉴定

2．6 序列拼接与分析

3 结果与分析

3．1 基因组DNA提取结果检测

3．2 PCR扩增结果

3．3 布莱凯特黑牛COQ2基因测序结果分析

3．4 布莱凯特黑牛与其他物种COQ2基因编码序列同源性分析

3．5 布莱凯特黑牛PPT氨基酸结构的分析

3．6 布莱凯特黑牛与其他物种间COQ2基因系统进化树的构建

4 讨论

4．1 COQ2基因引物1片段的PCR扩增

4．2 目的基因连接、转化操作

4．3 布莱凯特黑牛COQ2基因cDNA序列分析

4．4 布莱凯特黑牛COQ2基因鳊码序列及氨基酸序列分析

5 小结

第二部分 布莱凯特黑牛COQ2基因部分外显子多态位点分析

1 试验材料

1．1 试验样本

1．2 主要试剂

1．3 试剂配制

2 试验方法

2．1 基因组DNA提取

2．2 引物设计与合成

2．3 PCR扩增

2．4 SSCP分析

2．5 纯合子克隆测序

2．6 群体遗传学分析

2．7 COQ2基因外显子1多态性与胴体性状的关联性

3 结果与分析

3．1 PCR扩增结果

3．2 SSCP检测结果及序列分析

3．3 COQ2基因多态位点的群体遗传学分析

3．4 COQ2基因外显子1突变前后蛋白质二级结构分析

3．5 外显子1多态性与胴体性状相关性分析

4 讨论

4．1 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染条件分析

4．2 COQ2基因外显子1多态性分析

4．3 COQ2基因外显子3多态性分析

4．4 多态性与性状关联性分析

5 小结

结论

参考文献

附录

导师组意见

致谢

攻读硕士期间科研学术成果