局部转染lvOX40Ig和lvCTLA4Ig对同种异体复合组织移植的免疫调节作用及机制研究

摘要

目的：
　　探讨重组lvOX40Ig和lvCTLA4Ig局部转染同种异体复合组织移植阻断共刺激途径，观测目的基因在同种异体复合组织移植后对机体的免疫调节作用，以及局部表达OX40Ig和CTLA4Ig发挥免疫调节机制的研究。
　　方法:
　　构建了重组慢病毒载体OX40Ig和CTLA4Ig，体外同种异体复合组织局部目的基因转染，使移植物局部能够分泌OX40Ig和CTLA4Ig融合蛋白。检验慢病毒载体目的基因在293细胞的表达，验证其构建是否成功。采用近交系大鼠下腹壁浅动脉皮瓣移植模型，检验lvOX40Ig和lvCTLA4Ig介导的目的基因局部表达对阻断OX40/OX40L以及CD28/B7共刺激途径、延长移植物存活时间的作用。实验分为6组，组Ⅰ：未处理组；组Ⅱ：LvEGFP组；组Ⅲ：小剂量雷帕霉素治疗组；组Ⅳ：LvOX40Ig联合小剂量雷帕霉素组；组Ⅴ：LvCTLA4Ig联合小剂量雷帕霉素组；组Ⅵ：LvOX40Ig+LvCTLA4Ig联合小剂量雷帕霉素治疗组。比较各组移植物成活状况。检验其在移植物以及全身中的表达，混合淋巴细胞反应检验其免疫调节活性。检测移植后各组免疫细胞，细胞因子以及免疫相关趋化因子的变化。
　　结果：
　　体外转染LvOX40Ig和LvCTLA4Ig后，单一雷帕霉素治疗相比较空白对照组移植物存活时间差别有统计学意义，单一灌注LvOX40Ig或者LvCTLA4Ig联合小剂量雷帕霉素治疗与空载体病毒组比较能够显著延长移植物的存活时间，差别有统计学意义（P<0.05）。组织病理学检查术后7天，空载体病毒组与空白对照组符合Banff2007标准的Ⅲ级及以上免疫排斥反应，在各个单一基因联合小剂量雷帕霉素组及综合用药组的组织切片中可以观察到移植物存活状态显著提高，显微镜下无免疫排斥反应的表现。移植物术后28天观察显示，空白对照组，空载体病毒组以及雷帕霉素组同种异体皮瓣无一存活。剩余三组LvOX40Ig组，LvCTLA4Ig组以及综合用药组的皮瓣表现出中等程度淋巴细胞浸润。Westernblot以及PCR免疫荧光组织化学显示移植物局部目的基因的高表达，但是内脏器官无目的基因表达，术后45天仍有目的基因的表达。流式细胞术检测CD4，CD8细胞含量以及比值的变化，提示各组与综合治疗组比较CD4+T细胞含量减低，CD4/CD8比值下降，免疫荧光组织化学显示移植物中FOXP3+T细胞含量显著上升。ELISA检测血中各细胞因子含量显示综合治疗组IL-2，INF-γ水平下降，IL-4，IL-10水平明显上升。免疫组织化学检测趋化因CCR5的变化，可见空白对照组中CCR5阳性细胞数高于综合治疗组的CCR5阳性细胞数。
　　结论:
　　实验表明，OX40Ig以及CTLA4Ig局部基因治疗联合小剂量的雷帕霉素协同作用可延长移植物的存活时间。该方法有效地减小了术后早期全身免疫抑制剂的用量，为异体复合组织移植免疫耐受的诱导提供了新方法。

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声明

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缩略语表

中文摘要

英文摘要

前言

文献回顾

1 复合组织移植历史回顾：

2 同种异体手移植临床研究进展

3 异体颜面复合组织移植临床进展

4 CTA 的药物治疗进展

5 CTA 诱导免疫耐受机制

6 展望

正文

实验一 CTLA4Ig 及 OX4OIg 融合基因重组慢病毒载体的构建及生物学鉴定

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 体外局部转染 LvCTLA4Ig 及 LvOX4OIg对大鼠同种异体复合组织移植的免疫调节作用

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 体外局部转染 LvCTLA4Ig 及 LvOX4OIg对大鼠同种异体复合组织移植的免疫机制研究

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小 结

参考文献

附录

个人简历和研究成果

致谢