肝细胞癌及其癌前病变组织中相关抑癌基因的遗传学研究

摘要

背景：
　　肝细胞癌(hepatocellularcarcinoma,HCC)是最常见的恶性肿瘤之一；发病率居第五位，在癌症死亡原因中居第三位。近来流行病学调查研究显示其发病具有显著的地域差异，全世界80％的病例分布在亚洲、非洲等发展中国家和地区；而在北欧、西欧和北美等地区其发病率较低，但最近几年HCC在这些地区的发病率也呈现出上升趋势。HCC的发生发展不仅和环境因素有关，如乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)感染、丙型肝炎病毒(hepatitisCvirus,HCV)感染、黄曲霉毒素(aflatoxins,AFT)、酒精和烟草等；另外，遗传因素也起到重要作用。近年来对HCC发生发展机制的研究表明，原癌基因的激活和抑癌基因的失活是该肿瘤发生的关键环节。许多研究发现在HCC组织中染色体1p、4q、6q、8p、13q、16q和17p的特定区域存在高频率杂合性缺失(lossofheterozygosity,LOH)，在发生染色体LOH的位点附近可能存在与HCC发生相关的肿瘤抑制基因。还有研究发现在HCC发生的早期，异型增生结节(dysplasticnodules,DNs)和肝细胞腺瘤(hepatocellularadenoma,HA)等病变中也发生了与HCC类似的遗传学变异，并且因此被认为是HCC的癌前病变；这些病变组织中染色体8p、17p、5p、13q、14q和16q等区域也存在基因片段的缺失，这就表明在HCC中出现的遗传学改变有可能会出现在肝癌癌前病变中。因此，我们不仅要对HCC，同时也要对其癌前病变进展过程中所涉及的遗传学改变进行深入的探讨，为HCC的诊治提供更为精确的理论依据。
　　目的：
　　本实验通过对染色体4q和8p上具有高度多态性的9个微卫星位点在HCC和变异肝细胞结节(nodulesofalteredhepatocytes,NAH)标本中LOH率的检测，并在蛋白质水平进一步检测目的基因编码蛋白质的表达，分析研究与HCC及NAH发生发展相关的抑癌基因。为HCC的预防、早期诊断和治疗提供精确的分子标志物。
　　方法：
　　1、收集HCC标本和NAH标本；采用显微切割方法选出NAH细胞，和HCC标本一起用等体积酚氯仿抽提基因组DNA；
　　2、对所选出的9个微卫星位点D4S2954、D4S3331、D4S3030、D4S415、D8S1725、D8S1754、D8S1810、D8S1827、D8S552，依据在GeneBank数据库设计的引物分别进行聚合酶链式反应(polymerasechainreaction,PCR)，变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色，然后分析个各位点LOH的发生率，选出在HCC和NAH中LOH发生率较高的位点，并查找其所对应的基因；
　　3、应用S-P免疫组织化学法检测目的基因编码蛋白质在HCC组织、NAH组织及其各自正常对照组织中的表达情况，进行统计学分析。
　　结果：
　　1、在45例信息性HCC病例中，9个微卫星位点总的染色体LOH率为66.7％；其中D8S552位点的LOH率最高位41.9％；通过χ2检验或者Fisher确切概率法进行统计学分析(P<0.05)，得出该位点在性别(P=0.023)，血清甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)(P=0.004)和有无肝内转移(P=0.023)均有统计学差异；D4S415是22.5％，D4S3331是22.3％，D8S1810是18.8％，D4S2954和D4S3030是15.4％，D8S1725是12.5％，D8S1827是9.8％,D8S1754是6.3％；
　　2、在38例变NAH标本中微卫星位点D8S552的LOH发生频率为7.89％；
　　3、45例HCC中12例肝经常性丢失基因(deletedinlivercancer1gene，DLC-1)编码的蛋白表达阳性，阳性率为26.7％；相对应的自身癌旁组织36例DLC-1蛋白表达阳性，阳性率为80％；对两种组织中蛋白的表达率进行卡方检验(χ2=25.71,P<0.05)，DLC-1在HCC和癌旁组织中的表达差异有统计学意义；DLC-1蛋白在HCC中的表达在不同的年龄、性别中无差异，肿瘤的大小、是否有肝内转移、是否伴有肝硬化及血清乙型肝炎表面抗原(hepatitisBsurfaceantigen,HBsAg)水平均无差别；
　　4、在38例NAH标本中检测DLC-1蛋白表达，阳性的有26例，阳性率为68.42％。正常对照组织中有30例阳性表达，阳性率为78.9％。对两种组织中蛋白的表达率进行卡方检验(P=0.442,P>0.05)，该蛋白在NAH和正常肝组织中的表达差异无统计学意义。
　　结论：
　　1、染色体4q和8p上的三个位点D4S415、D4S3331和D8S552的杂合性缺失是HCC发生中的重要事件，提示几个位点的附近可能存在着与HCC相关的潜在抑癌基因；并且为HCC相关的其他抑癌基因研究提供理论依据；
　　2、微卫星位点D8S552在NAH组织中发生了LOH，提示NAH病变可能为HCC的一种癌前病变；
　　3、DLC-1蛋白在HCC组织中的表达水平显著低于癌旁肝组织中的表达水平，这在蛋白质水平验证了DLC-1基因可能是HCC发生相关的抑癌基因。

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缩略语表

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前言

文献回顾

1 HCC 的病因

2 HCC 发生的遗传学改变

3 HCC 发生的表观遗传学

4 肝癌癌前病变的遗传学改变

5 DLC-1 基因的研究现状

正文

实验一 肝细胞癌染色体 4q 和 8p 杂合性丢失的研究

0 引言

1 材料与方法

2 结果

3 讨论

4 小结

实验二 DLC-1 基因在肝细胞癌和变异肝细胞结节病变中的表达及其意义

0 引言

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 小结

结论

参考文献

个人简介和研究成果

致谢