Notch信号负调节因子SEL1L对体外培养小鼠切牙颈环细胞凋亡的影响

摘要

牙冠发育完成后，上皮根鞘（Hertwig’sepithelialrootsheath，HERS）的形成启动了牙根发育已成为共识，然而牙根发育启动的分子机制尚不明了。啮齿类动物切牙根尖端唇侧干细胞龛可以持续分化成釉细胞并形成釉质，使切牙终生持续生长。而磨牙则跟人类的牙齿一样形成HERS，启动了牙根发育。因此啮齿类动物切牙常作为牙根发育障碍的研究模型。Notch信号有助于维持切牙颈环干细胞龛，SEL1L是Notch信号的负调节因子。前期研究发现SEL1L在磨牙强阳性表达，切牙弱阳性表达，推测SEL1L有助于打破颈环干细胞微环境，形成HERS并启动牙根发育。
　　本研究采用体外细胞培养、免疫组织化学、细胞转染、RT-PCR等技术手段实现体外培养切牙颈环细胞SEL1L过表达，观察其对颈环细胞凋亡的影响，以探讨SEL1L是否通过促进颈环细胞的凋亡，打破了颈环结构中的干细胞微环境，从而使颈环结构转变为双层细胞的上皮根鞘结构，启动了牙根发育。主要内容和结果如下：
　　实验一酶消化组织块法原代培养小鼠切牙颈环上皮细胞
　　取出生后7～8天（postnatal7-8day,PN7～8d）的昆明小鼠，断颈处死后提取切牙根尖端唇侧颈环组织。I型胶原酶和dispaseⅡ蛋白酶混合液消化后接种组织块进行原代细胞培养，胰酶差别消化法去除成纤维细胞以获得纯化的上皮细胞。免疫组化检测上皮细胞标记物角蛋白的表达。结果发现3-7天后组织块周围可见梭形成纤维细胞及多角形上皮细胞混合存在，采用胰酶差别消化后得到多角形、聚集生长铺路石样纯化的上皮细胞，角蛋白阳性表达。本实验采用酶消化组织块法成功培养切牙颈环上皮细胞，角蛋白免疫染色验证其为上皮来源。操作简便易学，兼具酶消化法及组织块法的优点。小鼠切牙颈环上皮细胞成功培养为进一步研究目的分子SEL1L的功能打下了基础。
　　实验二小鼠pEGFP-N2-SEL1L表达载体鉴定及颈环细胞转染
　　采用DH5α感受态细胞转化并筛选pEGFP-N2-SEL1L重组质粒，目的基因PCR及酶切鉴定目的基因阳性表达的重组质粒后测序。选取浓度及纯度适合的质粒利用脂质体2000转染颈环上皮细胞。结果发现16～18h后可见单个克隆菌落长出，挑取菌落并摇菌，提取质粒。PCR可见目的基因条带，单酶切及双酶切后均可见相应DNA条带。测序结果显示目的基因与GenBank数据库中SEL1L基因高度重合。转染24h后荧光显微镜下观察可见绿色荧光表达。本实验成功提取并鉴定目的基因SEL1L已与空白质粒相连接的重组质粒；并采用脂质体2000成功转染颈环上皮细胞，实现SEL1L的过表达。
　　实验三pEGFP-N2-SEL1L转染小鼠切牙颈环上皮细胞鉴定及凋亡检测
　　RT-PCR检测转染后颈环上皮细胞SEL1L、Notch1及Hes1的表达，判断目的基因是否成功转染，SEL1L表达是否上调。采用DAPI染色进行凋亡细胞形态学观察，RT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-3及Bcl-2的表达。结果发现与空载体对照组相比较，重组质粒组SEL1LmRNA表达增强，Notch1及Hes1mRNA表达减弱。重组质粒组细胞呈凋亡形态改变的明显多于空载体对照组，Caspase-3mRNA表达增强，Bcl-2mRNA表达减弱。本实验采用RT-PCR检测SEL1L、Notch1及Hes1mRNA的表达，进一步验证了已将pEGFP-N2-SEL1L重组质粒成功转染切牙颈环细胞，并且SEL1L可发挥功能；采用DAPI染色及RT-PCR技术成功检测出SEL1L过表达的颈环上皮细胞凋亡率增加。
　　综上所述，本研究发现SEL1L分子可能通过促进颈环细胞的凋亡，打破颈环干细胞的微环境，从而使颈环结构转变为双层细胞的上皮根鞘结构，进而启动牙根发育。

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前言

文献回顾

一 Notch 信号通路与牙齿发育的研究进展

二 牙根发育启动的研究进展

正文

实验一 酶消化组织块法原代培养小鼠切牙颈环上皮细胞

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验二 小鼠 pEGFP-N2-SEL1L 表达载体鉴定及颈环细胞转染

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

实验三 pEGFP-N2-SEL1L 转染小鼠切牙颈环上皮细胞鉴定及凋亡检测

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

全文总结

附图

参考文献

个人简历和研究成果

致谢