原发性胆汁性肝硬化相关单抗1F9的抗原分离与鉴定

摘要

背景：
　　原发性胆汁性肝硬化（Primary biliary cirrhosis，PBC）是一种由自身免疫反应介导的、以肝内小胆管进行性破坏性、非化脓性炎症为特点的慢性肝内胆汁淤积性疾病，病程呈进行性，可发展至肝纤维化、肝硬化。近年来，由于对PBC认识程度和疾病诊断水平的提高，PBC检出率呈现逐年增高的趋势，作为非病毒性肝病，PBC的危害不容忽视。目前认为，PBC发病是遗传因素与环境因素相互作用的结果，但具体机制仍未阐明。由于 PBC病人多表现为胆汁排泄障碍，尝试从胆汁排泄角度入手寻找与 PBC发病相关的新分子。
　　肝细胞是一种极性细胞，其胆管侧细胞膜上存在着多种特异性表达分布的酶、骨架蛋白、通道蛋白、离子交换体和转运体，共同参与肝细胞物质运输及胆汁排泄。有研究显示，PBC患者肝细胞胆管侧细胞膜极性分子存在结构和功能异常。
　　1F9单克隆抗体是本课题组前期以 PBC患者肝细胞胆管侧膜性组分为免疫原，利用单克隆抗体技术筛选获得的PBC相关单克隆抗体之一。前期研究发现，该单抗所识别的抗原在正常肝脏组织中呈极性分布，主要位于肝细胞胆管侧；PBC患者肝脏组织中1F9抗原的表达随疾病进展逐渐增强，且部分患者中1F9抗原极性消失、分布紊乱，提示1F9抗原可能对PBC病理诊断具有重要意义。由于对1F9抗原认识有限，很大程度上限制了后续深入研究。因此，本研究拟在前期研究基础上，进一步明确1F9抗原与PBC的相关性，分离并鉴定1F9抗原，为后续机制研究奠定理论基础。
　　目的：
　　1、进一步明确1F9抗原与PBC的相关性；2、分离、鉴定1F9抗原。
　　方法：
　　1、采用免疫组织化学，研究1F9抗原在正常肝脏、PBC、乙型病毒性肝炎、药物性肝病、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病，共6种肝脏组织标本中的表达与分布，进一步明确1F9抗原与PBC的相关性。
　　2、检测并分析1F9单抗亚型，轻、重链可变区序列及二级空间结构；采用蛋白组学技术包括免疫沉淀、SDS-PAGE凝胶电泳和质谱分析（MALDI-TOF-TOF及LC-MS/MS），分离、鉴定1F9候选抗原。
　　3、通过免疫沉淀产物Western blot分析，验证1F9单抗与LAMP2单抗对对方抗原的交叉识别；通过连续组织切片免疫组化检测，观察1F9抗原与LAMP2在多种正常组织及PBC疾病组织中的表达与分布；通过免疫荧光/激光共聚焦，观察1F9抗原与LAMP2在细胞中的共定位情况；通过真核表达系统，观察1F9单抗对外源LAMP2蛋白的识别；通过免疫电镜技术，观察1F9抗原与LAMP2在正常肝脏及PBC疾病状态下的亚细胞定位。
　　结果：
　　1、对来源于2006年至2012年第四军医大学西京医院病理科的正常肝脏组织32例、PBC174例、乙型病毒性肝炎87例、药物性肝病44例、酒精性肝病23例、非酒精性脂肪性肝病53例，共6种石蜡包埋的肝脏组织标本进行切片、染色，观察1F9抗原在不同肝脏组织中的表达与分布。免疫组化结果显示，正常肝脏中，1F9抗原呈极性分布，主要位于肝细胞胆管侧；无胆汁淤积的肝脏疾病（乙型病毒性肝炎、药物性肝病、酒精性肝病和非酒精性脂肪性肝病）中，1F9抗原的表达与正常肝脏无明显变化；PBC患者肝脏中，1F9抗原的表达随疾病进展逐渐增强，约51％（88/174）的患者中1F9抗原呈现不同程度地分布紊乱、极性消失，弥漫性分布于肝细胞胞浆中，提示1F9抗原与PBC密切相关。
　　2、1F9单抗亚型为IgG1/κ，轻、重链可变区序列及二级结构已明确。肝癌细胞系HepG2和肾小管上皮细胞系HK2中1F9抗原呈阳性表达。选择HepG2和HK2两株细胞系，利用1F9单抗进行免疫沉淀富集1F9抗原，免疫沉淀产物经SDS-PAGE凝胶电泳分离后分别进行银染和Western blot验证。银染结果显示，两株细胞系中均成功富集到～110kDa的蛋白带，Western blot证实该蛋白带可被1F9单抗特异性识别。分别对两株细胞系中富集到的～110kDa蛋白带进行切胶、酶解，同时利用两种质谱分析方法MALDI-TOF-TOF和LC-MS/MS进行检测，通过生物信息学检索，结合分子量、组织分布等信息，获得1F9候选抗原 Lysosome-associated membrane glycoprotein2（LAMP2）。
　　3、经鉴定，现已明确1F9抗原为LAMP2：①HepG2和HK2两株细胞系中，1F9单抗免疫沉淀的蛋白可被1F9单抗、LAMP2单抗特异性识别，而不能被LAMP1（LAMP1为LAMP2同源分子）单抗识别；同时，LAMP2单抗免疫沉淀的蛋白也可被1F9单抗、LAMP2单抗特异性识别，且不能被LAMP1单抗识别；②免疫组化结果显示，1F9抗原和LAMP2在多种连续正常组织及PBC组织中的表达、分布相似；③免疫荧光/激光共聚焦结果证实， HepG2和HK2细胞系中，1F9抗原与LAMP2呈现良好的共定位现象；④犬肾上皮细胞系MDCK中1F9抗原和LAMP2均不表达，分别将LAMP1质粒和LAMP2质粒瞬时转染MDCK细胞，提取细胞总蛋白进行Western blot分析，结果显示1F9单抗可以识别外源表达的LAMP2蛋白，而不能识别外源表达的LAMP1蛋白；⑤免疫电镜结果显示，正常肝脏中，1F9抗原与LAMP2定位相似，主要分布于肝细胞胆管侧细胞膜附近的囊泡膜，囊泡直径大小从50至400纳米不等；PBC患者肝组织中，LAMP2表达增强、分布紊乱的特点也与1F9抗原相似，具体表现为：PBC中，囊泡数量明显增多，标记有胶体金颗粒的囊泡弥漫性分布于整个细胞浆，且胶体金颗粒除分布于囊泡膜外，囊泡腔内也出现胶体金颗粒聚集，同时，肝细胞胞浆内还存在一部分与囊泡毫无关系的可溶性LAMP2分子（散在分布的胶体金颗粒）。
　　结论：
　　本研究进一步证实了1F9抗原与PBC的相关性：①PBC患者肝脏中，1F9抗原表达增强；②1F9抗原表达增强与PBC病理分级正相关；③51％（88/174）的PBC患者肝脏中，1F9抗原呈现不同程度地分布紊乱、极性消失。
　　本研究明确了1F9单抗亚型，轻、重链可变区序列及二级空间结构，并最终证实1F9抗原为 LAMP2：①通过免疫沉淀——质谱分析（MALDI-TOF-TOF及LC-MS/MS方法）策略，获得1F9候选抗原LAMP2；②通过免疫沉淀产物Western blot分析，证实1F9单抗与LAMP2单抗可以相互识别对方抗原；③通过连续组织切片免疫组化检测，证实1F9抗原与LAMP2在多种正常组织和PBC疾病组织中的表达、分布一致；④通过免疫荧光/激光共聚焦，证实1F9抗原与LAMP2在细胞系中共定位良好；⑤通过LAMP2真核表达产物Western blot分析，证实1F9单抗可以识别外源表达的LAMP2蛋白；⑥通过免疫电镜技术，证实1F9抗原与LAMP2在正常肝脏组织及PBC疾病状态下的亚细胞定位相似。

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缩略语表

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英文摘要

前言

文献回顾

（一）、PBC 的概念及特点

（二）、肝细胞是参与胆汁排泄的重要细胞

（三）、肝细胞胆管侧极性分子异常与多种胆汁淤积性疾病密切相关

（四）、1F9 单抗的建立及意义

（五）、LAMP2 分子及其功能

正文

第一部分 1F9 抗原与 PBC 的相关性研究

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第二部分 1F9 候选抗原的鉴定

1 实验材料

2 方法

3 结果

4 讨论

第三部分 1F9 候选抗原的验证

1 材料

2 方法

3 结果

4 讨论

小结

参考文献

个人简历和研究成果

致谢